Enterobakt riumok coliformok e coli s salmonella kimutat sa
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 62

Enterobaktériumok , Coliformok , E. coli , és Salmonella kimutatása PowerPoint PPT Presentation


  • 171 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Enterobaktériumok , Coliformok , E. coli , és Salmonella kimutatása. 3. gyakorlat. Indikátor mikrobák. Enterobacteriaceae család (bélbaktériumok) Coliformok Escherichia coli Salmonel lák. Enterobaktériumok. Indikátor baktériumok, jelenlétük fekáliás szennyeződésre utal.

Download Presentation

Enterobaktériumok , Coliformok , E. coli , és Salmonella kimutatása

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Enterobakt riumok coliformok e coli s salmonella kimutat sa

Enterobaktériumok, Coliformok, E. coli, és Salmonellakimutatása

3. gyakorlat


Indik tor mikrob k

Indikátor mikrobák

  • Enterobacteriaceae család (bélbaktériumok)

  • Coliformok

  • Escherichia coli

    Salmonellák


Enterobakt riumok

Enterobaktériumok

Indikátor baktériumok, jelenlétük fekáliás szennyeződésre utal.

Előfordulás: emberi és állati béltraktus, felszíni vizek, talajflóra

Jellemzőik:,

Gr-, rövid pálcák, általában peritrich csillóval

mozognak,

fakultatív anaerobok

oxidáz negatívak

NO3→NO2-vé redukálják

glükózt bontják sav (esetleg gáz) termelés mellett


Enterobakt riumok kimutat sa

Enterobaktériumok kimutatása

Lemezöntés:VRBG-agar, (hagyományos lemezöntés + fedőréteg 4 ml)

kristályibolya-neutrálvörös-epe-glükóz, 37oC, 24 óra

értékelés: 0,5 mm-nél nagyobb, ált. 2-3 mm-es, kerek, sötétvörös, csapadékkal körülvett (epesavas sók kicsapódnak, Na-dezoxikolát, Na-taurokolát) telepek

Folyékony: BBG-leves: brillantzöld-glükóz-epe leves, 37oC, 24 óra

értékelés: zavaros és kisárgul → VRBG agarra


Enterobakt riumok coliformok e coli s salmonella kimutat sa

VRBG


Oxid z pr ba

OXIDÁZ-próba

1%-os parafenilén-diamin-oldat

negatív: sárgás

pozitív: kékes

Pár másodperc - perc,

A vas katalizálja!(üvegbottal, műanyag kaccsal végezhető)

Enterobaktériumok:negatív


Ferment ci s pr ba

FERMENTÁCIÓS próba

Szőlőcukros magas agar (egy telepet leszúrunk), 37 oC, 24 óra

pozitív: sárga, gázt termel

Enterobaktériumok: az eredetileg piros színű agar főleg az alján sárgul ki (fak. anaerob), és homogén (mert mozog a szúrási csatornából)

s


Sz l cukros magasagar

Szőlőcukros magasagar


Katal z pr ba

KATALÁZ próba

1 kacsnyi telep + pár csepp 10%-os H2O2 tárgylemezen → +: pezseg

Enterobaktériumok: pozitív


Coliformok

Coliformok

Laktózt 30°C-on egyidejű sav és gáz termelés mellett bontják

Escherichia (E. coli), Klebsiella (K. oxytoca),

Citrobacter (C. freundii), Enterobacter (E. aerogenes) nemzetség

  • Gr-, vaskos pálcák,

  • epét vagy epesót tartalmazó táptalajban 30°C hőmérsékleten sav- és gázképződéssel bontják a laktózt,

  • Többnyire a normál bélflóra tagjai, de van kivétel is (pl. E. aerogenes, amely soha nem fordul elő a bélben)

  • Jelenlétük a friss fekáliás szennyeződést valószínűsíti


Enterobakt riumok coliformok e coli s salmonella kimutat sa

Klebsiella


Coliformok kimutat sa

Coliformok kimutatása

VRBL táptalaj (kristályibolya-neutrálvörös-laktóz-epe)

  • gátlóanyag: kristályibolya, Na-dezoxikolát

  • savtermelés → neutrálvörös → piros, precipitációsudvar, min. 1 mm

  • 0,5 mm átmérőjű, sötétpiros (lilás-vörös) telepek

    Endo agar

  • gátlóanyag: Na-szulfit, fukszin

  • laktóz→savak, aldehidek→aldehid+fukszin-szulfit → felszabadul a fukszin → vörös telepek

    (E. coli esetében ez olyan intenzív, hogy a fukszin kikristályosodik → fémes zöld fukszin-fény)


Vrb agar

VRB agar


Endo agar

Endo agar


Coliformok kimutat sa1

Coliformok kimutatása

BBLleves (brillantzöld-laktóz-epe leves), Durham cső, 30°C, 24-48 óra, zavarosodás+1/10 gáz → Coliform gyanús

Laurilszulfát-laktóz-leves

gátlóanyag: Na-lauril-szulfát

Durham cső, 30°C, 48 óra → 1/10 gáz

X-leves (szintetikus táptalaj)

ammóniumsó, laktóz, puffer, nyomelemek


Kromog n coliform agarok

Kromogén Coliform agarok


Escherichia coli

Escherichia coli

Csak a bélcsatornában él, jelenléte mindig friss fekáliás kontaminációt jelez (index mikroba)

Önmagában többnyire ártalmatlan, vagy hasznos, egyes törzsei kórokozók (pl. E.coli O157 H7)

Kimutatása során el kell különíteni a Coliformoktól


Imv e c pr b k

IMV(E)C próbák

Eijkman-próba: tenyészetből 1 kacsnyit BBL-levesbe → 44,5°C 48 óráig vízfürdőben inkubáljuk → gyanús: zavaros + 1/10 gáz Durham csőben

→ VRBL agar → nutritív agarra szélesztjük az E. coli gyanús piros 2 mm átmérőjű telepet, és ezekkel végezzük el az IMVEC próbákat


I mv e c pr b k

IMV(E)C próbák

Indolképzési próba: TRIPTONVÍZbe oltunk, 24 óra 44,5°C inkubáció

0,5 ml KOVÁCS-reagens (p-dimetil-amino-benzaldehid amil-alkoholos sósavval savanyított oldata)

1 perc: + felszínen meggypiros gyűrű

Triptofán + víz → piroszőlősav + indol → +KOVÁCS-reagens → ROZINDOL festék


I m v e c pr b k

IMV(E)C próbák

Metilvörös próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 óra 37°C inkubáció

1-2 csepp METILVÖRÖS reagens

+: az egész leves színe élénkpiros

–: az egész leves színe sárga

A kevertsavas, és a butándioloserjesztést végző baktériumokat különíti el egymástól (E.colikevertsavas erjesztést végez)


Im v e c pr b k

IMV(E)C próbák

VP próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 óra, 37°C inkubáció

0,2 ml 5%-os alkoholos naftol-oldat

0,1 ml 40%-os KOH

2 csepp 0.5%-os kreatin-oldat

2 óra múlva

+: tenyészet felső része piros

A glükózt butándiolosan erjesztő baktériumok kimutatására szolgál.


Im v e c pr b k1

IMV(E)C próbák

VP-próba

Glükóz → acetil-metil karbinol (acetoin) [ez a butándiolos erjedés egy köztes terméke]

↓ O2, KOH

diacetil

↓ +kreatin

piros szín


Imv e c pr b k1

IMV(E)C próbák

Citráthasznosítási próba: ALAPLEVES, 4-6 óra inkubáció, 37°C-on,

majd oltótűvel CITRÁTOS magas-ferde agarba szúrunk és a felületén is szélesztünk → 24-48 óra, 37°C inkubáció→

+: eredeti zöld KÉK-re vált

-: eredeti zöld szín marad, nincs baktérium-növekedés

(Brómtimolkék pH=6,8-on zöld, pH=7,6-on kék)


Az imv e c pr b k rt kel se

Az IMV(E)C próbák értékelése


D gl kuronid z pozit v escherichia coli kimutat sa

β-D-glükuronidáz pozitív Escherichia coli kimutatása

β-D-glükuronidáz enzim kimutatása MUG-al

MUG ( 4-metil-umbelliferil-D glükuronid):

umbelliferil→ β-D-glükuronidáz → umbelliferon (fluoreszkál)

β-D-glükuronidáz enzime csak az E. colinak van (néhány Salmonella és Shigella törzstől eltekintve), a fluoreszcencia így nagy valószínűséggel E. coli jelenlétére utal. (E. coli O157:H7 nem képes ilyen enzimet termelni!)

E. coli MPN: laurilszulfát leves + MUG


Gl kuronid z pozit v e coli sz m nak meghat roz sa

β-glükuronidáz-pozitív E. coli számának meghatározása

Minta (10 g/ml) + peptonvíz (90 ml), hígítási sor

TBX (tripton-epe-glükuronid) agar lemezöntés (1 ml)

Inkubálás 44± 1 oC 18-24 óra

Pozitív telep: kék

További megerősítő vizsgálatok nem szükségesek!


Salmonella

Salmonella

  • Enterobacteriaceae család

  • Gram -, nem spórás

  • Önálló mozgásra képes, peritrich csillós

    kivétel: S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Typhi

  • 1 faj (Salmonella enterica), a szerotípusokat így írjuk: S. Enteritidis, S. Senftenberg, S. Typhimurium, S. Infantis, stb. (nagybetű, nem dőlt!!)

  • Fakultatív anaerob

  • Laktózt nem bontja, de

  • Salmonella subgenus III (Arizona)-ba tartozó törzsek

    laktóz +, ONPG +

  • Salmonella subgenus II-be tartozó törzsek között

    laktóz -, ONPG +


Ltal nos tulajdons gok

Általános tulajdonságok

Növekedés: 7-49,5°C, optimum: 35-37°C

pH=3,8-9,5, optimum pH=7-7,5

Ellenálló képesség:

  • Fagyasztástól nem pusztul el

  • Alacsony vízaktivitás mellett (pl.: csokoládé: aw=0,3-0,5) sokáig (hónapokig) túlél, és megnő a hőtűrő-képessége

  • Az alacsony pH-t kevésbé bírja, mint az E. coli

  • D idők:

    • 60°C-on 2-6 perc

    • 70°C-on <1 perc

    • (alacsony vízaktivitáson extrém hosszú túlélés: D-idő 70°C-on 1050 perc)

  • 0,1% ecetsav (pH=5,1) jelenlétében a növekedése gátolt


Salmonell k kimutat sa

Salmonellák kimutatása

A Bizottság 2073-2005/EK rendelete az élelmiszerek mikrobiológiai kritériumairól

Kimutatási protokoll: MSZ EN ISO 6579 szerint

Mintavétel:

  • 25 g (vagy egyes esetekben 10 g) minta

  • 100 cm2 lemosásával vagy ismert mennyiségű öblítőfolyadék

    Minta előkészítése: homogenizálni, majd azonnal leoltani.

    Szükség esetén 0-5°C-on 1 órát lehet várakozni.


Teny szt si protokoll el d s t ssal kombin lt d s t s i

Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás I.

25 g vizsgálati anyag + 225 ml előmelegített pufferolt peptonvíz

H O M O G É N E Z É S

18±2 óra 37±1°C (elődúsítás)

0,1 ml1 ml

↓ ↓

+10 ml RVS dúsító +10 ml MKTTn dúsító

↓ ↓

24±3 óra 41,5±1°C24±3 óra 37±1°C

↓ ↓


Teny szt si protokoll el d s t ssal kombin lt d s t s ii

Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás II.

↓ ↓ ↓ ↓

XLDMásik táptalajXLDMásik táptalaj

↓ ↓ ↓ ↓

24±3 óra 37±1°C 24±3 óra 37±1°C

Jellemző telepek kiválasztása ↓

Kioltás nem szelektív tápagarra (24±3 óra 37±1°C)

Biokémiai próbákSzerológiai próbák


D s t k

Dúsítók

RVS: Rappaport-Vassiliadis dúsító

Malachitzöld, Mg-klorid, NaCl, K-dihidrogén-foszfát, pH=5,2±0,2

MKTTn: Müller-Kauffmann-tetrationát-novobiocin

Na-tioszulfát, marhaepe, brillantzöld, lugol-oldat, CaCO3, novobiocin, pH=8,2±0,2

Régen használatban volt még:

Bierbrauer-féle leves: Na-tioszulfát, lugol-oldat, marhaepe, CaCO3, malachitzöld, brillantzöld

Szelenit-cisztin leves: Na-szelenit, laktóz


Szil rd t ptalajok xld

Szilárd táptalajok - XLD

XLD agar: Xilóz-lizin-dezoxikolát agar

xilóz, laktóz, szacharóz (egyiket sem bontja!), L-lizin-hidroklorid, Na-tioszulfát, ammónium-vas(III)-citrát, Na-dezoxikolát

(eredetileg vörös színű a táptalaj)

  • Xilóz, laktóz, szacharóz savvá bontása → sárga szín

  • H2S képződése → vas-szulfid → fekete szín

  • Lizin → kadaverin (dekarboxilálás) → telepek körül bíbor szín (pH-változás)

  • Na-dezoxikolát: Proteus telepek rajzásának gátlása, Gram+-okat gátolja

    Salmonella: telepek színe azonos a táptalaj színével (vöröses-bíbor), gyakran fekete középpel


Enterobakt riumok coliformok e coli s salmonella kimutat sa

XLD


Egy b szil rd t ptalajok

Egyéb szilárd táptalajok

BPL agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz agar

lila, apró telepek, mivel pH nő (savra sárgulna)

Brillantzöld gátolja a Gram+-okat, a S. Typhi-t és a Shigellákat

BPLS agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz-szacharóz agar

Sem a laktózt, sem a szacharózt nem bontja, így liláspiros telepeket képez. A laktóz negatív, de szacharóz pozitív zavaró flórát lehet vele kiszűrni.

Drigalski agar: sötétkék telep, mert Salmonella laktózból nem termel savat, sőt fehérjebontás miatt a pH megemelkedik

Rambach agar:propilénglikol bontás, telep piros (savképzés - neutrálvörös indikátor), egyes estekben színtelen: S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Typhisuis, S. Gallinarum

SS agar: Salmonella-Shigella agar

laktóz, marhaepe, Na-tioszulfát, Na-citrát, ammónium-vas(III)-citrát, brillantzöld, neutrálvörös

Szulfidképződés → fekete közepe lesz a telepeknek

Laktózt nem bontja → vörös marad a táptalaj


Enterobakt riumok coliformok e coli s salmonella kimutat sa

BPLS


Az msrv agar

Az MSRV agar

MSRV agar: Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis agar

  • A kimutatás a Salmonellák mozgékonyságán alapul: a Salmonella-migráció a félfolyékony tápközegben opálos udvaros növekedést eredményez.

  • Nagy háttérfertőzöttségű minták esetén (pl.: bélsár-minta, cloaca-tampon) a dúsítási folyamatban az RVS dúsító helyett használatos. Ilyenkor a dúsítás végén a rajzás széléről kell továbboltani.


Biok miai meger s t s

Biokémiai megerősítés

TSI ferde agar: Triple-sugar-iron agar

10g laktóz, 10g szacharóz, 1g glükóz, Fe-citrát, Na-tioszulfát, fenolvörös

1. Glükóz bontás: (TSI)

savképzéssel +

sav és gáz +

2. Laktózbontás: - , (TSI)

Salmonella enterica subsp. arizonae: + vagy – laktózbontás

3. Szacharóz bontás: - (TSI)

4. H2S termelés: +, (TSI)


Biok miai meger s t s1

Biokémiai megerősítés

RÖVID BIOKÉMIAI SOR

1. Glükóz bontás: +

2. Laktózbontás: általában -

3. Szacharóz bontás: -

4. H2S termelés: +

5. Karbamid bontás: -

6. Indolképzés: -

7. Lizin-dekarboxilálás: +

8. Voges-Proskauer próba: -

9. ONPG-reakció: általában -


Tsi agar

TSI agar

  • TSI alja sárga:

    glükóz pozitív

  • TSI teteje piros:

    laktóz és szacharóz negatív

  • Fekete foltok a TSI agarban:

    H2S-termelés


Biok miai pr b k

Biokémiai próbák

5. Ureáz-próba: (Karbamid bontás) -

(karbamid leves, 37°C, 24-48 óra)

értékelés: karbamid bontás esetén a felszabaduló NH3 a fenolvörös indikátor színét rózsaszínre, később lilára változtatja


Biok miai pr b k1

Biokémiai próbák

6. Indolképzés: -

(triptonvíz, 37°C, 16-24 óra, Kovács-reagens)

értékelés: - sárga


Biok miai pr b k2

Biokémiai próbák

7. Lizin-dekarboxilálás: +

(lizin leves, 37°C, 20-24 óra)

értékelés: + zavaros, bíborlila (brómkrezol-bíbor),

(- : sárga lenne)


Biok miai pr b k3

Biokémiai próbák

Karbamidbontás:

negatív

Lizin-dekarboxiláz:

pozitív


Biok miai meger s t s2

Biokémiai megerősítés

8. Voges-Proskauer próba: -,

CH3 CH3

CH-OH 40%-os KOH C=O

C=O α-naftol, kreatinin C=O

CH3 CH3

acetoindiacetil (piros)

9. ONPG-reakció(o-nitrofenil β-D-galaktopiranozid): -


Lakt z bont s

Laktóz bontás

Laktáz (β-galaktozidáz) enzim laktóz bontása


Onpg reakci

ONPG reakció

(0,25 ml fiz. só, toluol, ONPG korong, 37°C, pár perc)

értékelés: - nincs színváltozás, (+: sárga lenne)

Salmonella enterica subsp. arizonae: ONPG+


Szerol giai azonos t s

Szerológiai azonosítás

Önagglutináció kizárása:

1 csepp fiziológiás konyhasó oldat + kacsnyi törzs

1 perc múlva nagyítóval vizsgáljuk az agglutinációt,

  • Ha pozitív: szerológiai azonosítás nem lehetséges


Szerol giai azonos t s1

Szerológiai azonosítás

O-antigén: anti-O szérum konyhasóoldatban (szomatikus antigén)

Vi-antigén: anti-Vi szérum konyhasóoldatban (fehérje jellegű burok-antigén, az egész baktériumot beburkolja)

H-antigén: anti-H szérum (H-flagellar),


Az eredm nyek rt kel se

Az eredmények értékelése


Pozitivit s eset n

Pozitivitás esetén

Döntő szerológiai azonosítás:

A Salmonella vagy feltehetően Salmonella törzseket megerősítésre vagy szerotípus meghatározásra a

  • Nemzeti Salmonella Központba (Országos Epidemiológiai Központ) vagy a

  • Salmonella Referencia Központba (MGSZH) kell küldeni.


Salmonella bakteriof g

Salmonella bakteriofág


F g tipiz l s

Fág-tipizálás


  • Login