1 / 48

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ. Цаур Г . А Центр детской онкологии и гематологии Областная детская клиническая больница № 1 Екатеринбург. Молекулярно-генетические методы. Полимеразная цепная реакция (PCR) Методика разветвленных зондов ( branched DNA )

tybalt
Download Presentation

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЦаурГ.А Центр детской онкологии и гематологии Областная детская клиническая больница № 1 Екатеринбург

  2. Молекулярно-генетические методы • Полимеразная цепная реакция (PCR) • Методика разветвленных зондов (branched DNA) • Транскрипционно-опосредованная амплификация • Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) • Амплификация с вытеснением цепи (SDA) • Гибридный захват (HC) • Лигазная цепная реакция (LCR) • Другие... • QB репликаза, Биочипы

  3. Молекулярно-генетические методы Ломают границы между традиционными лабораторными технологиями Клиническая химия Гематология Микробиология Вирусология Генетика

  4. Kary B. Mullis • 1993 Saiki R, Scharf S., Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysisfor diagnosis of sickle cell anemia.Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4.

  5. Схема ПЦР

  6. метка гаситель праймер матрица полимераза ПЦР в реальном времени флуоресценция полимераза полимераза А.В.Мисюрин

  7. ПЦР в реальном времени Пороговый цикл Пороговое значение

  8. 105 копий 106 копий 107 копий

  9. Сравнение результатов ПЦР и ПЦР в реальном времени

  10. ПЦР в реальном времени HCV Количество геномных эквивалентов / мл Качественное определение HCV

  11. Преимущества ПЦР в реальном времени 1. Повышение специфичности метода за счет наличия зонда; 2. Возможность количественного определения; 3. Автоматизация; 4. Снижение риска контаминации за счет отсутствия электрофореза; 5. Снижение времени проведения реакции; 6. Уменьшение площади, занимаемой ПЦР-лабораторией

  12. Зачем использовать ПЦР? Быстрее по сравнению с традиционными генетическими и микробиологическими методами Эффективны для мониторинга эффективности лечения Относительно просты в исполнении Высокая чувствительность Не существует альтернативных методовдиагностики

  13. Оборотная сторона Быстрее по сравнению с традиционными генетическими и микробиологическими методами но часто необходимы дополнительные методы верификации Эффективны для мониторинга эффективности лечения Относительно просты в исполнении требует высокой квалификации персонала Высокая чувствительность существует потенциальная опасность ложно+ результатов (контаминации) Не существует альтернативных методовдиагностики

  14. Направления применения ПЦР • Инфекционная микробиология / Санитарная эпидемиология • Диагностика и мониторинг терапии онкологических и онкогематологических заболеваний • Наследственные заболевания • Тестирование на наличие генетически-модифицированных компонентов в продуктах питания • Фармакогеномика • HLA-типирование

  15. Революция в диагностике инфекционных заболевания • Быстрое и точное определение возбудителей бактериальных и вирусных инфекций, в т.ч.некультивируемых и медленно растущих • Терапевтический мониторинг эффективности лечения при вирусных заболеваниях • Определение устойчивости к антибиотикам • Открытие и идентификация новых вирусов • Эпидемиологические исследования (особенно для социально значимых инфекций) • Выработка стратегии по контролю инфекционных заболеваний

  16. Молекулярная микробиология • Вирус гриппа • Вирусы парагриппа • SARS • Парвовирус B19 • HAV • Toxoplasma • Legionella • Chlamydia • N. Gonorrhoeae • Mycobacterium spp. • Mycoplasma & Ureaplasma • Bordetella • Helicobacterpylori • MRSA • Candida И другие • HIV-1 & 2 • HCV • HBV • EBV • CMV • HSV 1, 2, 6 типов • VZV • HPV • JC & BK вирусы • Энтеровирусы • Риновирус • Аденовирус • РС-вирус • Метапневмовирус • ВирусЛихорадки Западного Нила

  17. Острый лимфобластный лейкоз СОЗРЕВАНИЕ B-клеток

  18. Острый миелобластный лейкоз

  19. Солидные опухоли

  20. Факторы прогноза

  21. Оценка эффективности терапии(МРБ)

  22. Мониторинг количества химерного гена MLL-AF4(МРБ) ПациентА.Г, КМ Пациент A.K., КМ Динамика снижения MLL - AF4в костном мозге и периферической крови Стандартная криваядля плазмиды MLL - AF 4 Slope -3.573 Y-Intercept 39.025

  23. Клонирование генов — создание трансгенных животных, генетически модифицированных растений (1) ДНК организма А, упакованная в хромосомы. (2) ПЦР. (3) Множество копий 1 гена из организма A. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида со встроенным геном из организма А. (6) Вставка плазмиды в организм B. (7) Увеличение числа копий гена организма А в организме B.

  24. Тестирование на наличие генетически-модифицированных ингредиентов • Соя линия 40-3-2 • Кукуруза линия GA-21 (терминатор Nos) линия MON 810

  25. Наследственные заболевания • Муковисцидоз - 7 мажорных мутаций гена CFTR (F508, G17173A, G542X, R553X, 3905insertion T, W1282X, N1303K) • Миодистрофия Дюшенна • Гемофилия А и В - более 100 мутаций • Болезнь Вильсона-Коновалова - 70 мутаций в гене БВК, наиболее часто His1069Gln • Гемохроматоз (C282Y, H63D)

  26. Направления применения ПЦР • Идентификация личности (+отцовство) «геномная дактилоскопия» • Исследование эволюционной теории Электрофорез амплифицированных в ходе ПЦР фрагментов ДНК • Отец. (2) Ребенок. (3) Мать. У ребенка есть часть генов от каждого из родителей. И это дает новую уникальную комбинацию

  27. Геномная дактилоскопия

  28. Фармакогеномика Субстраты для CYP2D6 и CYP2C19

  29. Фармакогеномика для индивидуализирования терапии Предположительно, не ответят на терапию Высокий риск токсических эффектов Лечение альтернативными дозами препаратов Предположительно, ответят на терапию Лечение обычными дозами препаратов

  30. HLA-типирование HLA-антиген II класса HLA-антиген I класса HumanLeukocyteAntigens • Подбор пары донор-реципиент при трансплантации • Определение предрасположенности к заболеваниям: • -Сахарный диабет I типа • -Целиакия • -Анкилозирующий спондилоартрит • -Ревматоидный артрит http://www.genomediagnostics.com

  31. HLA-типирование • ПЦР-SSP • ПЦР-SSO • Секвенирующее типирование

  32. HLA-типирование. ПЦР-SSP

  33. Совместимость по системе HLA для ТГСК National Marrow Donor Program, NMDP USA (2004)

  34. Принцип подбора доноров:отличия HLA-типирования «низкого» и «высокого» разрешения J.M. Tiercy, Prague, 2007

  35. Контроль качестваПреаналитический этап В.В. Меньшиков Клиническая лабораторная диагностика, 2006, №3

  36. Оценка качества РНК Свежий материал RIN 8.3 Транспортировка 2 дня, комнатная температура Транспортировка 4 дня, комнатная температура Хранение 1 день, комнатная температура

  37. Чувствительность метода • Теоретическая 10-6 • Реальная(на примере MLL-AF4 протокол EAC) Костный мозг 5*10-4 – 6*10-5 Кровь 1*10-4 –7*10-4

  38. Различия в стандартах Плазмиды b2m другой производитель Плазмиды b2mIpsogen Slope -3.450 Y-Intercept 38.718 Slope -4.385 Y-Intercept 50.128 1 430 000 копий 27 890 000 копий

  39. Программа контроля качества EQUAL • Одинаковые праймеры и зонды • Одинаковые разведения стандартной кДНК • Одинаковые образцы крови с неизвестной концентрацией • Разная химия (полимераза, обратная транскрипция для неизвестных образцов) • Разные приборы для ПЦР в реальном времени

  40. кДНК 5,526 *101 копийгена ABL min 2,569*101 max 541,170*101 103 102 101 Ramsden et al.:Clinical Chemistry 52, No. 8, 2006

  41. Образец крови с неизвестным количеством копий гена ABL 106 105 104 Min 0,180*104 mean 5,632*104 max 21,284*104 Ramsden et al.:Clinical Chemistry 52, No. 8, 2006

  42. Программа контроля качества GLEEM К562 – клеточная линия, несущая химерный ген BCR / ABL, характерный для ХМЛ T. Zhang et al Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 4, September 2007

  43. Обязательно типировать образцы в повторах (в идеале в триплетах), особенно при низкой концентрации исследуемого гена-мишени T. Zhang et al Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 4, September 2007

  44. Воспроизводимость по гену b2m. Образцы от пациентов с неизвестной концентрацией

  45. Воспроизводимость Ct b2m

  46. Различия в приборном парке Амплификация

  47. Различия в приборном парке M Silvy et al Leukemia (2005) 19, 305–307

  48. Благодарю за внимание!

More Related