1 / 60

Augu genomu struktūra

Augu genomu struktūra . Nils Rostoks . Mācību plāns un lekciju saraksts . Sintēnija. Sākotnēji šis termins nozīmēja, ka gēni ir uz vienas hromosomas, t.i., sintēniski (no grieķu valodas burtiski “uz viena pavediena”)

trapper
Download Presentation

Augu genomu struktūra

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Augu genomu struktūra Nils Rostoks

  2. Mācību plāns un lekciju saraksts

  3. Sintēnija Sākotnēji šis termins nozīmēja, ka gēni ir uz vienas hromosomas, t.i., sintēniski (no grieķu valodas burtiski “uz viena pavediena”) Termins tiek plaši lietots, lai uzsvērtu, ka gēnu kārtība hromosomā dažādiem organismiem ir vienāda (sintēniska) Mikrosintēnija – gēnu kārtības saglabāšanās nelielā genoma rajonā Kolinearitāte – gēnu (marķieru) kārtības saglabāšanās

  4. Gēnu kārtības saglabāšanās evolūcijas gaitā (sintēnija)

  5. Kukurūzas – rīsu gēnu sintēnija Rīsu hromosoma ir sintēniska kukurūzas 3 un 8 hromosomai. Sintēnijas pielietojums genomu kartēšanā

  6. Cilvēka – šimpanzes un cilvēka – peles genomu salīdzinājums Genomu salīdzinājumi ļauj atbildēt uz fundamentāli atšķirīgiem jautājumiem Cilvēks – pele. Iespējams identificēt gēnus un kontroles elementus, kas saglabājušies nemainīgi evolūcijas gaitā. Var pētīt proteīnu funkcionālos domēnus, kas saglabājušies nemainīgi, vai arī gēnus, kas atšķir abus organismus Cilvēks – šimpanze. Genomi, tai skaitā nekodējošā DNS, ļoti līdzīgi, kas ļauj identificēt mutācijas, kas radušās tieši cilvēka evolūcijas gaitā. Iespējams identificēt mutācijas gēnos un kodējošās daļās, kas potenciāli atšķir cilvēku no šimpanzes

  7. Miežu – rīsu un miežu – Arabidopsis salīdzinājums • Miežu – rīsu salīdzinājums • Miežu un rīsu līnijas atdalījās pirms 40 – 50 miljoniem gadu. Miežu un rīsu genomā nereti saglabājusies gēnu kārtība hromosomā. Zinot rīsu genoma sekvenci, iespējams paredzēt kādi gēni atradīsies atbilstošā miežu genoma rajonā • Miežu – Arabidopsissalīdzinājums • Viendīgļlapji un divdīgļlapji atdalījās pirms >100 miljoniem gadu. Nav saglabājusies līdzība gēnu kārtībā hromosomā. Iespējams salīdzināt gēnu un to kodēto proteīnu struktūru. Līdzīgiem gēniem nereti vēl aizvien ir arī līdzīga funkcija

  8. Genoma struktūras variācija • Ģenētiskās analīzes pamatā ir atšķirības starp organismiem un to genomiem • Galvenās atšķirības starp genomiem ir: • - punktveida mutācijas; • - insercijas un delēcijas; • - kopiju skaita atšķirības; • - poliploīdija.

  9. Genomu dinamika • http://www.intl-pag.org/19/abstracts/W11_PAGXIX_076.html • http://www.intl-pag.org/19/abstracts/W94_PAGXIX_583.html

  10. Mutāciju frekvences • Cilvēka un peles salīdzinājums (75 miljoni gadu neatkarīgas evolūcijas) • Cilvēkiem mutāciju (aizvietoto bāzu pāru) frekvence - 2.2 × 10–9aizvietojumu uz vienu nukleotīdu gadā vai ~2.2 × 10–8 uz vienu nukleotīdu vienā paaudzē • Pelēm mutāciju (aizvietoto bāzu pāru) frekvence - 4.5 × 10–9 uz vienu nukleotīdu gadā vai ~10–9 uz vienu nukleotīdu vienā paaudzē • Kukurūzas Adh1 un Adh2 lokusos - 6.5 × 10–9 aizvietojumu uz vienu nukleotīdu gadā

  11. Punktveida mutācijas • Visbiežāk sastopamā atšķirība starp genomiem • Punktveida mutācijas notiek visās šūnās jebkurā laikā. Mutācijas somatiskos audos netiek nodotas pēcnācējiem. Mutācijas izraisa DNS replikācijas un reparācijas kļūdas, dažādi ķīmiskie savienojumi, UV un jonizējošais starojums • Mutācijas ir normāls process. Tām vajadzētu notikt ar +/- konstantu ātrumu, atšķirības mutāciju frekvencē liecina par izlasi • Mutāciju frekvence kodola, mitohondriju un hloroplastu genomos ir atšķirīgas (dzīvnieku mtDNS mutāciju frekvence augstāka nekā kodola genomā, bet augu cpDNS frekvence ir zemāka nekā kodola genomā

  12. Punktveida mutāciju iedalījums • Pēc DNS bāzu tipa • Tranzīcijas – transversijas • Pēc efekta uz proteīna sekvenci • Klusējošās vai sinonīmās mutācijas (aminoskābju sekvence nemainās, vai tiek aizvietotas ar funkcionāli līdzīgu aminoskābi) • Nesinonīmās mutācijas (atšķirīgas aminoskābes); • Nonsense mutācijas (translācijas terminatora kodons)

  13. Punktveida mutācijas

  14. Insercijas – delēcijas • Indeli – retāki kā punktveida mutācijas , it īpaši kodējošās daļās • Mikrosatelītu polimorfisms var tikt uzskatīts par indel veidu, piemēram: • AGCTGGATTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGGGAACTAC • AGCTGGATTGTGTGTGTGTGTGT..GTGGGGAACTAC • Indelus var izraisīt DNS replikācijas kļūdas, mobilo ģenētisko elementu insercijas, kā arī ķīmiskie mutagēni, UV un jonizējošā radiācija

  15. Insercijas – delēcijas

  16. Kopiju skaita variācija • Kopiju skaita variācija attiecas uz lieliem genomiskās DNS rajoniem (tūkstoši līdz miljoni bāzu pāru), kuri var būt atkārtoti genomā • Kopiju skaita variācija izraisa gēnu kopiju skaita izmaiņas un attiecīgi arī to kodēto proteīnu daudzuma izmaiņas šūnā • Visvairāk pētīta cilvēkos, bet pilnīgi noteikti ir novērojama arī augu genomā (Sebatetal. (2005) Large-scale copy number polymorphism in the human genome. Science, 305: 525)

  17. Poliploīdija • Poliploīdija augiem ir bieži sastopama • x – monoploīds hromosomu skaits, n – haploīds hromosomu skaits gamētās • Autopoliploīdija (piemēram, kartupeļi (2n = 4x = 48)) • Allopoliploīdija (piemēram, kvieši (2n = 6x = 42), tritikāle) • Genoma duplikācijas un segmentālas duplikācijas • Kukurūza un rīsi ir seni tetraploīdi • Patersonetal. (2004) Ancient polyploidizationpredating divergence of the cereals, and its consequences for comparativegenomics. PNAS, 101: 9903

  18. Poliploīdja • Poliploīdija var atgadīties spontāni vai tikt inducēta • Poliploīdi bieži ir sterili • Homologās hromosomas un homeologās hromosomas • Bivalenti, univalenti, trivalenti • Triploīdi (rodas diploīdas un tetraploīdas sugas krustojumos , x un 2xgamētas) • Eiploīdi, aneiploīdi

  19. Triticeaegenomuevolūcija

  20. Ph lokuss un heksaploīdo kviešu rašanās • Kvieši (Triticumaestivum) ir heksaploīdi, bet to hromosomas mejozē sadalās kā diploīdam (tātad n = 21) • Šo skaldīšanos nodrošina Ph lokuss uz 5B hromosomas, kurš novērš homeologo hromosomu pārošanos mejozē • Phlokuss ir izveidojies poliploidizācijas procesā pirms 8000 – 10000 gadiem • Ph lokuss atrodams tikai uz 5B hromosomas, bet ne 5A un 5D. Tas atrodams gan tetraploīdajos un heksaploīdajos kviešos, bet ne diploīdajās kviešu sugās

  21. Griffithsetal. (2006) Nature, 439: 749

  22. Rīsu genoma duplikācijas Patersonetal. (2004) PNAS, 101: 9903

  23. Salseetal. (2009) Reconstruction of monocotelydoneous proto-chromosomes reveals faster evolution in plants than in animals. PNAS, 106:14908)

  24. Arabidopsis genoma duplikācijas ArabidopsisGenomeInitiative (2000) Nature, 408: 796

  25. Molekulārie marķieri Nils Rostoks

  26. Marķieri • Almost all aspects of life are engineered at the molecular level, and without understanding molecules we can only have a very sketchy understanding of life itself • Francis Crick • Tāpat kā ceļojumā orientēties palīdz ceļa stabi, genomā orientēties palīdz marķieri

  27. Augu marķieri Morfoloģiskie marķieri – vārpas forma un plēkšņu krāsa Bioķīmiskie marķieri –dažāda izmēra proteīnu zonas SDS-PAGE Molekulārie marķieri – atšķirības DNS molekulas nukleotīdu secībā

  28. Molekulāro marķieru iedalījums • Pēc polimorfisma veida DNS molekulas sekvencē • Punktveida mutāciju marķieri, mikrosatelītu marķieri • Pēc genotipa noteikšanas metodes • Restrikcijas fragmentu garuma polimorfisms, CAPS (cleavedamplifiedpolymorphicsequence) • Pēc genoma sekvences veida • Gēnu (cDNS) marķieri, anonīmie marķieri, retrotranspozonu marķieri un tmldz.

  29. RFLP – restrikcijas fragmentu garuma polimorfisms AFLP – amplificētu fragmentu garuma polimorfisms SSR – mikrosatelītu garuma polimorfisms SNP – punktveida mutācija Molekulārie marķieri

  30. Baktēriju genoma restrikcijas analīze http://wheat.pw.usda.gov/~lazo/docs/xmal/rflps.html

  31. Polimorfisma detekcija noteiktā genoma rajonā • Augu genomi lieli un kompleksi un starp dažādiem vienas sugas indivīdiem pastāv ļoti daudzas atšķirības (polimorfismi) genoma līmenī • Kā noteikt atšķirības DNS sekvencē noteiktā genoma rajonā? • DNS zondes un DNS hibridizācija • Polimerāzes ķēdes reakcija ar specifiskiem oligonukleotīdiem

  32. RFLP shēma I Diploīds miežu genoms = 10x109bp RestriktāzeEcoRI (G^AATTC) vidēji šķeļ ik pēc 46=4096 bp Vidēji sagaidāmi 2.5x106 DNS fragmenti Botsteinetal. (1980) Constructionof a geneticlinkagemapin man usingrestrictionfragmentlengthpolymorphisms. American J HumanGenetics, 32:314.

  33. RFLP shēma II • Genomiskās DNS restrikcija ar EcoRI, DNS fragmentu elektroforētiska sadalīšana agarozesgelā

  34. Genomiskās DNS restrikcija RFLP analīzei Kang and Yang (2004) BMC Biotechnology, 4:20

  35. DNS tiek šķelta ar restrikcijas fermentu, fragmenti tiek sadalīti agarozes gēlā atbilstoši to garumam un noteiktu fragmentu garumu nosaka izmantojot hibridizācijas zondes. Pirmās paaudzes molekulāro marķieru kartes RFLP rezultāti

  36. RFLP trūkumi un priekšrocības • Nepieciešamas specifiskas zondes – pirmais solis RFLP genoma kartēšanā ir hibridizācijas zondu izveidošana • Laikietilpīga metode, Southern hibridizācija nav automatizējama • Relatīvi neliels alēļu skaits, problēmas ar krosshibridizāciju • Lielākoties kodominanti marķieri • Robusta metode, ja atstrādāti tehniskie aspekti, tā ir jutīga un droša • Vēl aizvien “zelta standarts”, pat salīdzinot ar mūsdienīgākām metodēm

  37. RFLP piemēri

  38. RFLP varianti • Genoma kompleksitātes samazināšana ar PCR, nevis specifiskām zondēm • Detekcijai izmanto fluorescentās krāsas, nevis autoradiogrāfiju, fragmentus sadala uz sekvenatora, nevis agarozesgelā

  39. T-RFLP • Terminālo restrikcijas fragmentu garuma polimorfisms • http://rdp8.cme.msu.edu/html/t-rflp_jul02.html

  40. Molekulārie marķieri – AFLP • DNS polimorfismu detekcija balstoties uz restrikcijas enzīmu šķelšanu • Uz PCR balstīta metode genoma kompleksitātes samazināšanai • Fragmentus sadala denaturējošā poliakrilamīdagelā (sekvenēšanasgelā), vai arī kapilārajā elektroforēzē • Vosetal. (1995) AFLP: a newtechniquefor DNA fingerprinting. NucleicAcidsRes, 23: 4407

  41. Selektīvo nukleotīdu skaita ietekme uz AFLP A – viens selektīvs nukleotīds B – divi selektīvi nukleotīdi C – trīs selektīvi nukleotīdi D – četri selektīvi nukleotīdi I – III dažādas praimeru kombinācijas

  42. AFLP kā universāla marķiersistēma I – Arabidopsis II – tomāts III – kukurūza IV – cilvēks

  43. AFLP priekšrocības un trūkumi • Dominantamarķiersistēma – DNS fragmenti tiek skaitīti kā +/- (1 vai 0) • Universāla marķiersistēma – izmantojama jebkuram organismam • Liels marķieru daudzums jau no dažām praimeru kombinācijām (van Osetal. (2006) Construction of a 10,000-marker ultradense genetic recombination map of potato: providing a framework for accelerated gene isolation and a genomewide physical map.Genetics, 173: 1075) • Iespējams automatizēt izmantojot fragmentu analīzi uz sekvenatora • Patentēta tehnoloģija

  44. Mikrosatelīti (arī SimpleSequenceRepeats (SSR)) , piemēram, (AG)15 Rajons, kas satur mikrosatelītu atkārtojumu tiek amplificēts ar PCR un fragmenti tiek sadalīti agarozes vai poliakrilamīda gēlos WeberandMay (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction.Am J Hum Genet, 44: 388 LittandLuty (1989) A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene.Am J Hum Genet, 44: 397 Molekulārie marķieri – SSR

  45. SSR

  46. SSR īpašības • Kodominanti marķieri • Liels skaits alēļu katrā lokusā • Viens noteikts polimorfisma veids • Nepieciešams neliels genomiskās DNS daudzums, tehniski vienkāršāki nekā RFLP • Iespējams analizēt lielu paraugu skaitu, it īpaši, ja izmanto fluorescenti iezīmētus DNS fragmentu analīzi ar kapilāro elektroforēzi

  47. SSR fragmentu kapilārā elektroforēze Wangetal. (2003) Genome Introgression of Festucamaireiinto LoliumperenneDetected by SSR and RAPD Markers. CropSci, 43: 2154

  48. SNP – singlenucleotidepolymorphism (punktveida mutācija) Restrikcijas ar AgeI Molekulārie marķieri – SNP

More Related