Studio della metabolismo ossidativo della Dopamina

1. Studio della metabolismo ossidativo della Dopamina

2. Neuromelanin formation

3. LOCALIZZAZIONE ATTIVITA’ DOPAMINO PEROSSIDASICA IN CERVELLO DI RATTO E UMANO * * *

4. Studio in vitro della formazione del dopaminocromo • La formazione di dopaminocromo è catalizzata in maniera simile da perossidasi purificate (lattoperossidasi, mieloperossidasi, perossidasi di rafano) e da una frazione di cervello di ratto, in presenza di perossido d’idrogeno. • La formazione di un intermedio radicalico, dopamino-o-semichinone, è comune nelle reazioni catalizzate da ciascuna delle perossidasi e dalla frazione di cervello di ratto. (Galzigna et al. Biochim Biophys Acta 1999)

5. Procedures Preparation of protein mixture: The midbrain fractions were homogenized and centrifuged. The supernatant, obtained after two successive centrifugations, was spectrophotometrically assayed for enzymatic activity. striato s.nigra Assay of peroxidizing activity Dopamine peroxidizing activity was in vitro followed spectrophometrically, as increasing absorbance at 475nm, corresponding to the peak of maximum absorption of the dopaminochrome formed from dopamine and hydrogen peroxyde.

6. Come si determina l’attività enzimatica • Attività enzimatica • ΔA475 rappresenta la variazione di assorbanza misurata a 475 nm; • ε è il coefficiente di estinzione molare del substrato cromoforo = 1175 M-1cm-1 • La determinazione è stata effettuata in un il volume totale della miscela (omogenato e tampone di lettura) di 10-3 L (Galzigna et al., 1999)

7. ATTIVITA’ DOPAMINO PEROSSIDASICA IN MESENCEFALO E GANGLI DELLA BASE DA REPERTI AUTOPTICI PARKINSONIANI E CONTROLLI Attività dopamino perossidasica in mesencefalo Controlli (media dei valori) = 249 (SD+/-191) mmol dopaminocromo/min/mg proteina PD (media dei valori) = 789 (SD+/-149) mmol dopaminocromo/min/mg proteina Attività dopamino perossidasica nei gangli della base Controlli (media dei valori) = 0 mmol dopaminocromo/min/mg proteina PD (media dei valori) = 529 mmol dopaminocromo/min/mg proteina *Significativamente differente dai controlli, p<0,001 con t di Student

8. CONCENTRAZIONE DELLE CATECOLAMINE IN MESENCEFALO E GANGLI DELLA BASE Cconcentrazione della dopamina nel mesencefalo Ccontrolli (media dei valori) = 62 nmol/L (SD+/-37) PD (media dei valori) = 31 nmol/L (SD+/-26) Cconcentrazione della dopamina nei gangli della base Ccontrolli (media dei valori) = 59 nmol/L (SD+/-35) PD (media dei valori) = 43 nmol/L (SD+/-22) *Significativamente differenti dal controllo : p< 0.05 con t di Student.

9. PROCEDURE ELETTROFORETICHE

10. Procedure elettroforetiche • Gel di poliacrilamide non denaturante: è utilizzato per il frazionamento di miscele proteiche che mantengono la loro conformazione nativa. • Esso non permette di distinguere gli effetti delle dimensioni, della struttura e della carica elettrica netta di ciascuna proteina sulla mobilità elettroforetica. • E’ utilizzato soprattutto quando si voglia studiare l’attività biologica di una proteina.

11. Procedure elettroforetiche • Gel di poliacrilamide denaturante in presenza di sodio dodecilsolfato (SDS-PAGE). • Prevede la denaturazione delle miscele proteiche al calore e il trattamento con agenti riducenti (2-α-mercaptoetanolo), che rompe i ponti disolfuri intra ed intercatena, causando lo “srotolamento” della struttura ripiegata della catena. La presenza dell’SDS assicura prolungata denaturazione, rompendo i legami covalenti, e, avvolgendo la proteina, le conferisce carica negativa, indipendentemente dalla sua carica netta. • Tutte le proteine della miscela migrano verso l’anodo, risolte in bande discrete, con una velocità inversamente proporzionale al logaritmo del loro peso molecolare. • Si attribuisce peso molecolare alle bande discrete mediante confronto della loro mobilità elettroforetica con quella di alcune proteine a peso molecolare noto

12. Protein mixtures of midbrain tissues homogenates from four different specimens were separated by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, in two corresponding gel sets The protein mixtures were separated along with horse radish peroxidase, which was present as peroxidatic actvity control. After electrophoresis running, one gel set was stained with the substrate solution (2mM DA, 30mM H2O2) and the second control gel set was stained with Coomassie Blue. Separation of protein mixture Q-mass spectrometry analysis A red/orange band diplaying peroxidatic activity and the corresponding band stained with Coomassie Blue were analysed by mass spectrometry.

13. DOPAMINE PEROXIDIZING ACTIVITY: DETECTION ON NON-DENATURING POLYACRYLAMIDE GEL A A A’ 1 2 3 4 HRP 1 2 3 4 HRP 1’ 2 ‘ 3’ 4’ HRP

15. Proteins identified in colorless, non-reactive band

16. Conclusions • We have developed a method for detecting on native gel a dopamine peroxidizing activity from human midbrain. • Q-mass spectrometry analysis of the activity bands revealed the presence, among the others, of two proteins: macrophage migration inhibitory factor (MIF) and Peroxiredoxin-1, highlighting a possible functional link among dopamine/dopaminochrome redox cycle and protein metabolism. • This method appears to be the first report of a peroxidatic activity in gel detection using dopamine and hydrogen peroxide as substrates.

17. PERSPECTIVES • Our findings, revealing a possible functional link among oxidative species and protein metabolism, are consistent with the latest studies on the pathogenic mechanism of PD. • The properties of MIF and Peroxiredoxin-1 present in the activity bands are consistent with their role in the maintenance of redox potential within cells. • New experimental approaches are under study in order to define the role of proteins found in the gel activity band, in particular of MIF and Peroxiredoxin-1, in oxidative metabolism of dopamine and in PD.

18. Cos’è la PROTEOMICA ? • La proteomica è una disciplina scientifica che permette lo studio del PROTEOMA, cioè delle PROTeine espresse da un genOMA in una particolare cellula, tessuto o organismo, sia esso animale o vegetale

21. Cos’è la SPETTROMETRIA DI MASSA • E’una tecnica analitica che permette di determinare la massa molecolare di un composto chimico. • Ha origine nella prima metà del 1900, grazie agli studi di J. Thompson, il quale osservò che, in un tubo sotto vuoto a cui venga applicata una differenza di potenziale, si formano elettroni e radiazioni positive. • Uno spettrometro di massa è uno strumento che misura la massa molecolare di una molecola, dopo che gli sia stata impartita una carica elettrica. Esso è, infatti, in grado di separare gli ioni molecolari in base al loro rapporto massa/carica.

22. MALDI MALDI-Tof MALDI, matrix.assisted laser desorption/ionization desorbimento: è un processo in cui una miscela viene evaporata da una superficie e ionizzata. Piastra maldi è un supporto d’acciaio: il campione dopo dogestione con tripsina e immerso in una matrice (acido organico) che funziona da solvente eminimizza le interazioni molecolari, assorbe parte dell’energia che viene impartita, ed ha un ruolo attivo anche nella formazione dell’evaporazione e formazione degli ioni per protonazione, cioè assorbono una carica positiva. Il campione depositatato sulla piastra viene lasciato cristalllizzare e bombardata con fotoni ad alta energia, proveneienti da raggio laser pulsato, quinid vengiono diretti verso l’analizzatore tof, che è un tubo, di lunghezza nota’in cui viene fatto il vuoto. Gli ioni vengono emessi ad un’energia cinetica costante ed indirizzati verso il tubo. E= i\e mv2, dove m è la massa dello ione e v la sua velocità. Minore sarà il rapporo massa\carica maggiore sarà la sua velocità.

23. Spettrometria di massa

24. Fragment fingerprinting del peptide selezionato: la sequenza parziale, insieme con la massa, costituisce un “tag” di sequenza che può essere utilizzato come probe, altamente specifico, per identificare proteine nei database proteici. • Lo spettro di frammentazione può anche essere analizzato automaticamente per mezzo di SEQUEST, un programma che consente la correlazione dei dati sperimentali con spettri teorici, generati da sequenze proteiche note presenti nei database.

25. Procedure elettroforetiche L’ elettroforesi BIDIMENSIONALE prevede due fasi: • IEF: Separazione delle proteine in base alle differenze nella loro carica netta mediante l’isoelettrofocalizzazione • SDS-PAGE: Separazione delle proteine focalizzate in base alla loro massa molecolare, in gel denaturante

26. Modello di ratto emiparkinsoniano La somministrazione di 6-OHDA riproduce, nel ratto, fenomeni di stress ossidativo determinati dalla riduzione dei complessi I e IV della catena respiratoria con un’iperproduzione mitocondriale di radicali liberi, quali lo ione superossido, di radicali idrossilici e di perossido d’idrogeno. Questa riduzione dell’attività dei complessi I e IV mitocondriali è probabilmente alla base della perdita di neuroni che si realizza, a livello della substantia nigra trattata, nel giro di due settimane. (A e B). A: denervazione dello striato ipsolaterale B: danno neuronale in s.nigra, dopo iniezione di 6-idrossidopamina (6-OHDA)

27. CONCLUSIONI • IL protocollo di estrazione e solubilizzazione delle proteine, messo a punto per il tessuto cerebrale, associato ad un programma mirato di isoelettrofocalizzazione, ci ha permesso di ottenere una soddisfacente risoluzione del corredo proteico delle sezioni di substantia nigra e di striato mediante separazione in doppia dimensione. • Significative variazioni di espressione di alcune proteine sono emerse dal confronto, effettuato mediante software d’immagine, dei profili proteici delle sezioni di tessuto neurodegenerato rispetto al controllo. Le proteine, individuate come significativamente differenti nei tessuti patologici rispetto ai controlli, sono state sequenziate in spettrometria di massa MALDI-TOF. • Nel campione di tessuto ottenuto dallo striato due spot che appaiono piu’ intensamente espressi nel profilo proteico dello striato indotto alla neurodegenerazione, rispetto al controllo, corrispondono alla b-actina. Lo spot proteico presente nel campione di substantia nigra trattato con 6-OHDA e non nel rispettivo controllo corrisponde ad un’enzima: l’a-enolasi ( 2-fosfo-D-glicerato idrolasi) (non neuronal-enolasi) (NNE). • L’ aumento dei livelli di espressione dell’a-enolasi e della b-actina, nei tessuti neurodegenerati rispetto al tessuto di controllo, potrebbe essere risultato dei fenomeni di ossidazione indotti dalla 6-OHDA. Entrambe le proteine appaiono coinvolte nei processi di neurodegenerazione ed è testimoniata l’ossidazione che esse subiscono nella malattia di Alzheimer. ( Castagna et al.,2002). • Il coinvolgimento di fenomeni di stress ossidativo nella patogenesi del morbo di Parkinson è infatti largamente dimostrato (Jenner et al. AnnNeurol, 2003; 53 suppl. S26-S38). I nostri risultati sono pertanto ricollocabili all’interno di tale scenario. Se l’a-enolasi e la b-actina possono essere considerate bersagli del processo di ossidazione che avviene a carico di molteplici proteine, nelle malattie neurodegenerative quali il morbo di Parkinson e la malattia d’Alzheimer, potrebbero rappresentare importanti indicatori diagnostici, sebbene occorra stabilire in quale fase della malattia insorgano le alterazioni osservate, per far luce sul fattore o i fattori d’innesco della neurodegenerazione. Solo in questo modo, infatti, sarà possibile risolvere il nesso di causalità della malattia, ancora purtroppo oscuro.

28. DOPAMINA

29. 6-IDROSSIDOPAMINA

30. Confronto tra i profili proteici ottenuti da sezioni di tessuto pH 4 pH 5 pH 4 pH 5 striato Substantia nigra 7 8 7 8 b-actina A: Neostriato controllo Neostriato trattato con 6-OHDA a-enolasi B: S. nigra controllo S. nigra trattata con 6-OHDA

31. pH4 pH7 pH4 pH7 Separazione miscela proteica di substantia nigra di ratto emiparkinsoniano mediante elettroforesi bidimensionale