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实验七、转基因生物的蛋白质水平检测. 实验目的： 学习转基因生物的蛋白质水平检测方法 —— 蛋白质提取及检测技术，包括全蛋白的提取和垂直板电泳。. 实验要求：掌握 外源基因的表达情况的检测方法，掌握蛋白质的提取及电泳技术。了解 垂直板电泳槽的使用方法和聚丙烯酰胺凝胶的配制。. 技术应用： 转基因生物外源基因的表达检测及目的 蛋白的分离及纯化。.
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实验七、转基因生物的蛋白质水平检测 实验目的：学习转基因生物的蛋白质水平检测方法——蛋白质提取及检测技术，包括全蛋白的提取和垂直板电泳。 实验要求：掌握外源基因的表达情况的检测方法，掌握蛋白质的提取及电泳技术。了解垂直板电泳槽的使用方法和聚丙烯酰胺凝胶的配制。 技术应用：转基因生物外源基因的表达检测及目的 蛋白的分离及纯化。
试剂：IPTG；酵母提取液；胰蛋白胨；NaCl；Tris-HCl（Ph6.8）；SDS； 甘油；DTT； CBB-R250；甲叉双丙烯酰胺（ Bis ）；丙烯酰胺（Acr）； SDS；丙三醇；ß-巯基乙醇；溴酚兰；过硫酸铵（ AP ）； TEMED；乙醇；冰醋酸；甘油； 甘氨酸 • 实验材料：转基因工程菌及受体菌BL21。
实验原理 • 1. 载体介绍： • 克隆载体: T-vector, pUC19,pBR322等等； • 表达载体：pET系列 启动子 终止子 • 原核表达 • 真核表达 根据启动子的转录模式可将其分为3类： 组成型启动子 组织或器官特异性启动子 诱导型启动子。
T7终止子 T7启动子
NOS 是胭脂碱合成酶的终止子的简写 花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子 玉米Ubiquitin启动子
2. 蛋白检测： • 对转基因生物中外源基因是否表达的最直接的方法就是检测是否有目的蛋白出现，在对目的蛋白的分子量，等电点等有所了解的基础上对转基因生物的总蛋白进行提取，通过电泳检测目的蛋白是否出现，从而可以知道外源基因是否表达。
实验流程 • 1. 细菌全蛋白的提取： • 菌液摇培过夜——IPTG诱导表达6-9小时——离心，（12，000 rpm，30秒）（3次）——加100µl裂解液——振荡，摇匀，加热变性——离心，（12，000 rpm，30秒）——加TE稀释后取上清点样12µl。 • 裂解液配方：0.0625M Tris-HCl（Ph6.8）；2% SDS；10%甘油（gLyceroil）；0.1M DTT； 0.01% CBB-R250。
2. 细菌全蛋白的SDS-PAGE电泳： • 电泳条件：浓缩胶电压为80V，进入分离胶后120V稳压电泳。电泳时间为溴酚蓝距离边缘1－2cm。
说明 • 1. 蛋白质（包括酶）的提取方法依据蛋白种类不同而异，大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
2.转基因微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。2.转基因微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。 2.1 对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，可以获得高产量的酶和核酸； 2.2 植物材料必须经过去壳、脱脂处理，同时生物大分子的含量与植物品种和生长发育状况及季节性关系密切。 2.3 对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
