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Méthodes d’études des acides nucléiques

Méthodes d’études des acides nucléiques. 1.Préparation , séparation et dosage des acides nucléiques. 1.1.Préparation Étapes : Broyage Délipidation Extraction : solution saline Précipitation des acides nucléiques par éthanol ou par acidification. 1.2.Dosage des ADN.

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Méthodes d’études des acides nucléiques

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Presentation Transcript

  1. Méthodes d’études des acides nucléiques

  2. 1.Préparation, séparation et dosage des acides nucléiques • 1.1.Préparation • Étapes : • Broyage • Délipidation • Extraction : solution saline • Précipitation des acides nucléiques par éthanol ou par acidification

  3. 1.2.Dosage des ADN • Dosage colorimétrique du phosphore • Dosage colorimétrique des pentoses • Par absorption UV 260 nm • A1 =A260nm • A2 = A280nm • Aref = A320 nm • cDNA = (A1-Aref)*62,9 –(A2-Aref)*36 • cProteines= (A2-Aref)*1552 –(A1-Aref)*57,3 • Ratio = (A1-Aref)/(A2-Aref)

  4. 1.3. Séparation électrophorétique Polyanions  Migration vers l’anode • Supports utilisés: • Gel d’agarose • Gel de polyacrylamide • Révélation : • Bromure d’éthidium • Colorant • Marqueurs radioactifs

  5. ADN sur gel d’agarose : coloration au bleu de Nile

  6. ADN sur gel d’agarose : Bromure d’ éthydium

  7. ADN de plasmide : puc18 / bromure d’éthidium

  8. 2. Détermination des séquences nucléotidiques • 2.1.Principaux types d’hydrolyse • 2.1.1. Hydrolyses chimiques: • Alcaline • Acide • 2.1.2. Hydrolyses enzymatiques : • Endonucléases • Exonucléases • Enzymes de restriction

  9. Eco RI : 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’

  10. 2.2.Détermination de la séquence d’un ADN Méthode de Sanger= méthode aux didésoxynucléotides

  11. Analyse sur séquenceur

  12. 3. Synthèse chimique des polymères nucléotidiques Fabrication des amorces pour la PCR

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