Arbuskul ární mykorrhiza

1. Arbuskulární mykorrhiza Základní informace Ekologický význam Metody studia

2. Nejčastější typy mykorhiz

3. Jak vypadá AM?

4. Struktura AM 1 Externí hyfy(80-90% DW) Mimo kořen se tvořící spóra Auxiliary cells Endofytickéstruktury podle M. Brundretta

5. Struktura AM 2

6. Taxonomie (fylogenetická) AM hub kmen Glomeromycota, dvě dosti nezávislé linie

7. Evoluce AM hub • Nejstarší typ mykorrhizy (450 miliónů let), pravděpodobně umožnil osídlení souše • Kompletní závislost na hostiteli • Na první pohled: omezená speciace (~200), nízká hostitelská specificita. Druhy jsou založené na morfologii spor. • Jenže pojem druh je sporný: asexuální, mnohojaderné (i ve fázi spór - genetická diversita), možná výměna jader. Selekce může působit na úrovni populace jader.

8. Výrazné arbuskuly, postupně se zužující větvičky Vesikuly v mezibuněčných prostorách, často citrónkovité Nemají auxiliární buňky Spóry se tvoří v kořenech nebo mimo ně, často ve shlucích Významné rody: Glomus

9. Podobný rod je Gigaspora, v Evropě možná méně častý? Arbuskuly - jemné členění kolem kyjovité basální hyfy Netvoří vesikuly v kořenech, místo nich auxiliární buňky mimo kořen Spóry tvoří mimo kořen, výrazně větší než Glomus Často velmi členité, "špagetovitě" nahloučené hyfy Dobře se barví Významné rody: Scutellospora

10. Arbuskuly často vyplňují celou buňku (cihličky) Často tvoří vesikuly (vnitrobuněčné, proto obvykle nepravidelný tvar) Netvoří akcesorické buňky, ale spóry obvykle mimo kořen Některé druhy se málo barví, obtížné pro kvantifikaci Významné rody: Acaulospora

11. Neznámé taxonomické postavení Špatně se izoluje, takže seo něm ví málo, ale je mnohdy velmi častý Tenké hyfy (1 μm), malé spóry Obvykle v povrchovějších vrstvách Někdy dělá arbuskuly podobné rodu Glomus, jindy deštníčky Nemá vesikuly (?), ale má ”laloky" Významné houby: fine endophyte

12. Ale různé druhy žijí pospolu... podle J.B. Mortona (INVAM) vytříděné druhy (od levého dolního rohu): Acaulospora koskei, Scutellospora heterogama, Archeospora leptoticha, Glomus sp.

13. Význam AM symbiózy pro kytky • Příjem půdních zdrojů (zejména P, ale i Zn, Cu, N, voda) - některé druhy si bez AM symbiózy nevystačí • Ochrana kořenů před patogeny (houby, bakterie) - též na úrovni společenstva • Vliv na interakci s hostitelskými herbivory (i nad zemí) - též přímá interakce se svými herbivory (Collembola, Nematoda)v rhizosféře • Významný vliv na úspěch hostitelských druhů ve společenstvu: často ve prospěch podřazených druhů (i les) • Common mycelial network – propojení mnoha rostlin • Vliv na morfologické a fyziologické vlastnosti hostitele: kontrolované pokusy bez AM často měří artefakty

14. Ekologie symbiotického vztahu • Jednotlivé AM houby se liší v užitečnosti pro hostitele, v rámci rostlinného společenstva se tato užitečnost liší i pro jednotlivé hostitelské druhy. Tak mohou být vyrovnávány kompetiční poměry mezi rostlinnými populacemi. Totéž platí i pro AM houby – ty se v konkurenci udržují díky efektivní symbióze s určitým hostitelským druhem. • Hostitel dodává houbě zhruba 5-20% fixovaného C, ale nemusí to představovat zátěž: jednak se snížením limitace P může zvětšit fotosyntetická plocha, jednak může být fotosyntéza omezována spotřebou (sink-limited) • AM symbióza může rostlině umožnit rychlejší přístupk organickému materiálu – přímý rozklad či jeho urychlení fragmentací organických částic

15. Základní metody výzkumu AM • kvantifikace v kořenech hostitele: pozorovací (morfotypy) • kvantifikace spór v půdě • navození AM symbiózy v skleníkovém pokusu: inokulum • potlačení AM symbiózy v skleníkovém pokusu • omezení AM symbiózy v terénu • izolace houbových symbiontů z terénu • molekulární identifikace v kořenech (příp. spór) • kvantifikace půdního mycelia

16. Metody: kvantifikace v kořenech • Barvení v prostředí laktoglycerolu • vyprání kořenů • rozpuštění buněčného obsahu (KOH) • případné odbarvení • okyselení (HCl) • barvení v laktoglycerolu: Chlorazol Black E, trypanová nebo anilínová modř, i další (inkoust) • ”odbarvení” v laktoglycerolu bez barviva • (polo)trvalé preparáty • Autofluorescence (zejména arbuskuly) • Imunofluorescence („druhově-specifické barvičky“) • Vitální barvení: sukcinát-dehydrogenáza • Kvantifikace: grid-line intersect method, problémy

17. Metody: kvantifikace spór • Izolace spór v sacharózovém gradientu: • odstranění kamínků; (homogenizace v mixéru) • zvlhčení a přesátí (32/38 μm síto; případně druhé 500/710 μm) • centrifugace v sacharózovém roztoku • vypláchnutí, třídění, preparáty (Melzerovo činidlo) • Nefunguje, je-li moc organického materiálu, pak jen vyplavit • Spóry vytvořené v terénu nejsou vždy dobroucharakteristikoureálného "společenstva" => trap cultures • terénní materiál (půda, segmenty kořenů) zředit sterilním pískem • vysít hostitelské rostliny (kukuřice, čirok, jetel, jitrocel) • po ukončení rozvoje indukovat sporulaci • vypreparovat spóry - viz výše • nicméně i zde problémy

18. Metody: izolace AM symbiontů • Trap cultures => izolace a vytřídění spór => inokulace

19. Metody: izolace AM symbiontů • Trap cultures => izolace a vytřídění spór => inokulace • Opakovaná purifikace • Problém se zlenivěním kultur • Problém s "čistotou" spór:

20. Kvantifikace metodami molekulární biologie • Většina studií založena na porovnání DNA sekvencíz různých částí genu kódujícího SSU pro rRNA (např. ITS) • Nutné selektivní namnožení pomocí PCR, s použitím primerů specifických pro arbuskulární mykorrhizní houby nebo pro jednotlivé rody (čeledi) • Místně vyladěné aplikace PCR (nested PCR) jsou zárukou úspěchu, proto je laboratoří s dobrými výsledky málo • Zlepšuje se schopnost charakterizovat přítomné genotypy (semi)kvantitativně: rt-PCR, immunofluorescence • Další metody: isoenzymy

21. Metody: navození AM symbiózy • Základem kvalitních pokusů jsou izoláty (inokulum) - pozor, některé skupiny (Glomus, Acaulospora) na produkci spór moc nespoléhají • Inokulum terénní, pokud nekontrolujeme identitu houby - může ale být problém s hostitelskou specificitou (optimálnost vztahu) Metody: potlačení AM ve skleníku • Sterilní substrát (vyvařený písek) • Sterilizace půdy (gamma záření, teplo) - problém mrtvolek • Přefiltrovaný půdní extrakt, sítem 32 um (zkontrolovat!) • Selektivní fungicid - jen velmi nepřesně selektivní

22. Metody: omezení AM v terénu • Benomyl (komerčně: Benlate => Bavistin => Fundazol) • Potlačuje i vybrané skupiny patogenních hub • Problém se zajištěním proniknutí ke kořenům • Nutné opakovat každých 4 - 6 týdnů • Kombinace s přísunem živin, často P