以 PU/PVA 包埋菌體顆粒於氣舉式反應器中處理含甲苯與乙酸乙酯廢氣之研究第一年度：造成抑制現象的原因探討

以PU/PVA包埋菌體顆粒於氣舉式反應器中處理含甲苯與乙酸乙酯廢氣之研究第一年度：造成抑制現象的原因探討以PU/PVA包埋菌體顆粒於氣舉式反應器中處理含甲苯與乙酸乙酯廢氣之研究第一年度：造成抑制現象的原因探討計畫編號：CHU-94-TR-05 主持人：黃思蓴教授環境資源與能源科技研究所參與人員：張慧玫助理教授生物資訊系徐增興助理教授土木與工程資訊學系

1.0 簡介 • 國內許多作業製程常用到大量的揮發性有機溶劑（VOCs），逸散所造成之污染相當普遍，對於環境及人類會造成重大的衝擊。 • 對於含VOCs的廢氣，一般皆採用物理–化學方法來處理，雖然處理效果良好，但相對的處理成本較高且可能會產生二次污染的問題，所以近年來以具低成本、高處理效率且無二次污染問題等優點的生物處理法最具發展潛力。 • 就噴塗業來說，其製程中所產生之廢氣以甲苯和乙酸乙酯為主，而甲苯和乙酸乙酯皆為高生物分解性之揮發性有機化合物，所以很適合用生物濾床來處理。本實驗室過去發現在高濃度乙酸乙酯存在下，甲苯與二甲苯之去除會受到抑制而導致處理效果大幅下降。 • 本研究首先想了解噴塗業所排放含甲苯和乙酸乙酯廢氣，在生物濾床處理時所產生的抑制現象，並且進一步探討使用固定化後來，該抑制現象是否能夠有效改善。

2.0 材料與方法 • 菌株來源 • Rhodococcus fascians AC6（只分解乙酸乙酯；中興李季眉教授）Rhodococcus sp.B5（可分解甲苯和乙酸乙酯；中興李季眉教授）PseudomonasputidaF1 ATCC 700007（只分解甲苯；新竹市食品所BCRC）。 • 菌種保存方法為採用繼代培養方法與低溫保存方法。 • 繼代培養方法為將純菌以平板法培養，保存約1個月。藉由替換固態培養皿，以重複進行培養達到菌種保存之目的。 • 低溫保存方法為將菌液與甘油（glycerol溶液濃度為20％）以1：1（v/v）混合注入2 ml之冷凍離心管中，並置入-20℃之低溫保存箱中進行保存。

2. 材料與方法 • 培養基 • 菌種的活化培養基為甲苯或乙酸乙酯等基質，以及酵母萃取液及豐味通。工作培養基則如表1所示。 • 氣相甲苯及乙酸乙酯分析 • 以氣密針筒抽取0.5 ml待測氣體樣品，注入氣相色層分析儀（GC/FID）中。 • 氣相層析儀（GC/FID）的操作條件，使用管柱：J&W, DB-5 融合矽膠毛細管柱，長30m, 內徑0.53mm ID，吸附膜為5.0 μm。操作溫度依序為：管柱加熱器：120 oC, 注射器：210 oC, 偵測器：230 oC。表1HCMM2培養基組成 (Ridgway et al., 1990)

2. 材料與方法 • 菌量測定方法 (1) 光學密度測量法 • 菌體量測定方法為濁度測定法（optical density，O.D.），利用波長為600 nm之分光光度計，測量待測樣品菌液之吸光度（O.D.600），並以培養液的上澄液校正之。樣品經過稀釋後之光學密度讀值需達0.5以下，方可進行測量。 (2) 蛋白質分析方法 • 蛋白質的測定採BCA測定法（BCA Protein Assay）（Pierce chemical company, 1997），可測定的蛋白質濃度範圍為20~2,000μg/mL。 • BCA分析試劑包括A、B兩試劑及2.0 mg / ml Albumin standard。將A與B試劑以50：1（v/v）的方式均勻混合作為Working Solution，有效保存期限為24小時。 • 取0.1 ml的蛋白質標準試劑或樣品，加入2 ml的Working Solution，置於37℃水浴槽中反應30分鐘後靜置至室溫，再以分光光度計於波長562 nm下量測其吸光度（O.D.562）。

3.1 單一菌株分解甲苯及乙酸乙酯的能力及最佳的成長條件 • 最佳培養條件 • 20%的植種率、pH 7、28 oC • 菌株分解能力 • 就乙酸乙酯而言，菌株AC6的分解能力明顯優於菌株B5 • 就甲苯而言，菌種B5的分解能力些微優於菌株F1。 • 而當甲苯及乙酸乙酯的負荷增加時，每一種菌株分解有機物所需的時間都明顯增加，但是仍然在可以分解的範圍之下。圖1、在相同T/E比，但增加VOC的負荷下，各種菌株生物分解甲苯與乙酸乙酯的情形：菌株AC6 (a)、菌株B5 (b,c)及菌株F1 (d)。〔註：菌株AC6 不能分解甲苯，而菌株F1 不能分解甲苯。〕

3.2 等比例增加T/E負荷對混合菌株分解有機物的影響 • 懸浮菌株降解>95%甲苯所需時間 • 各獨立菌株皆因為甲苯和乙酸乙酯的添加量增加，需要更多的時間來分解甲苯；即使是也是如此。 • 混合菌株所需的時間卻因為混合而造成嚴重的延遲；而且是愈高負荷，影響愈大。按推論，這是群族之間競爭的結果；而菌株AC6和B5對此效應比較輕微。 • 依據（Hwang et al., 2003），得知菌株AC6在某些條件下，的確可以幫助菌株B5快速分解乙酸乙酯，而讓菌株B5可以更專一地去分解甲苯，在生態學上形成了互助的效應。 : 需要大於24 h以上的時間來分解表2　在懸浮狀態下，同T/E比但增加負荷的條件下，使用單一或任兩組菌株組合(strains AC6 & B5, strains B5 & F1, and strains AC6 & F1) 而能達到95%甲苯去除率所需的時間

3.2 等比例增加T/E負荷對混合菌株分解有機物的影響 • 懸浮菌株降解>95%乙酸乙酯所需時間 • 各獨立菌株也會因為甲苯和乙酸乙酯的添加量增加，而些微增加所需要的時間來有效分解乙酸乙酯；即使是混合菌株也是如此。 • 混合菌株所需的時間卻只有在菌株B5和F1的組合下，才會造成嚴重的延遲，其他並不會太嚴重。 • 按推論，這也是群族之間競爭的結果；而菌株B5和F1因為使用相同的甲苯做為碳源，且效率相當，所以彼此之間有較嚴重的抑制現象。表3　在懸浮狀態下，同T/E比但增加負荷的條件下，使用單一或任兩組菌株組合(strains AC6 & B5, strains B5 & F1, and strains AC6 & F1) 而能達到95%乙酸乙酯去除率所需的時間

圖2、在相同T/E比，但增加VOC的負荷下，各種菌群以懸浮 (a,c) 的或是固定化(b,d) 的型式來分解甲苯 (a, b) 與乙酸乙酯 (c,d) 時，去除率達95%所需的時間：菌群AC6 & B5 ()、菌群B5 & F1 ()及菌群AC6 & F1 ()。 3.2 等比例增加T/E負荷對混合菌株分解有機物的影響 • 微生物固定化後對有機物分解的影響 • 由圖2(a)、2(b)的比較，得知在微生物固定化之後，分解甲苯所需的時間，亦隨有機物的負荷增加而些微增加；但所需要的時間不再為無限長。 • 至於乙酸乙酯，亦可見微生物固定化的幫助，但是沒有對甲苯顯著。 • 由於固定化的作法是將各菌株以固定的空間隔離開來，在理論上是不會有族群競爭的問題存在。

3.3固定添加4l甲苯而按比例增加乙酸乙酯對混合菌株分解甲苯的影響3.3固定添加4l甲苯而按比例增加乙酸乙酯對混合菌株分解甲苯的影響 • 懸浮菌株降解>95%甲苯所需時間 • 各獨立菌株在輕負荷時，皆因為甲苯的量固定，並不會隨乙酸乙酯的添加量增加，而需要更多的時間來分解甲苯。混合菌株卻會因乙酸乙酯添加量增加而增加分解甲苯所需的時間。 • 這說明固定量的甲苯受到乙酸乙酯增加的間接效應而增加所需的時間，例如，菌株B5和F1的組合最為嚴重（基質競爭衍生的族群競爭）。 • 菌株AC6和F1在乙酸乙酯的負荷較輕微時，因為沒有共同的基質，各菌株可以專一地進行甲苯或乙酸乙酯的分解；但在高負荷時，可能溶氧不足，而抑制。表4　在懸浮狀態下，以固定甲苯添加量（4 µl）下增加乙酸乙酯添加量(不同T/E比)，使用單一或任兩組菌株組合(strains AC6 & B5、strains B5 & F1及strains AC6 & F1) 而能達到95%甲苯去除率所需的時間

3.3固定添加4l甲苯而按比例增加乙酸乙酯對混合菌株分解甲苯的影響3.3固定添加4l甲苯而按比例增加乙酸乙酯對混合菌株分解甲苯的影響 • 微生物固定化後對有機物分解的影響 • 由圖3(a)、2(b)的比較，得知固定化菌體顆粒，分解固定量甲苯所需的時間，並不太會隨有機物的負荷增加而增加。 • 菌株B5和F1在固定化之後，可以有效地改善其原先在懸浮狀態下分解時間嚴重落後的現象。 • 由於固定化的作法，在理論上是不會有族群競爭的問題存在。由此可見，之前推論的基質抑制所衍生的族群競爭是正確的。圖3、在固定甲苯添加量(4-µl) 下改變T/E比，各種菌群以懸浮(a) 的或是固定化(b) 的型式來分解甲苯時，去除率達95%所需的時間：菌群AC6 & B5 (square )、菌群B5 & F1 (circle )及菌群AC6 & F1 (triangle )。

3.4 固定添加4l乙酸乙酯而按比例增加甲苯對混合菌株分解乙酸乙酯的影響 • 懸浮菌株降解>95%乙酸乙酯所需時間 • 由表中得知各獨立菌株皆因為乙酸乙酯的量固定，並不會隨甲苯的添加量而增加，而需要更多的時間來分解乙酸乙酯；但是混合菌株B5和F1卻會因甲苯的量增加而增加分解乙酸乙酯所需的時間。 • 由於甲苯量的增加，對於乙酸乙酯的分解時間沒有改變，這說明在此基質抑制的效應是不存在的。由於這次又以菌株B5和F1的組合所受到的抑制最為嚴重，由此可見他們在生態學上形成互斥的效應。表5　在懸浮狀態下，以固定乙酸乙酯添加量（4 µl）下增加甲苯添加量(不同T/E比)，使用單一或任兩組菌株組合(strains AC6 & B5、strains B5 & F1及strains AC6 & F1) 而能達到95%乙酸乙酯去除率所需的時間

圖4、在固定乙酸乙酯添加量(4-µl) 下改變T/E比，各種菌群以懸浮(a) 的或是固定化(b) 的型式來分解乙酸乙酯時，去除率達95%所需的時間：菌群AC6 & B5 (square )、菌群B5 & F1 (circle )及菌群AC6 & F1 (triangle )：菌群AC6 & B5 ( )、菌群 B5 & F1 ( )及菌群AC6 & F1( )。 3.4 固定添加4l乙酸乙酯而按比例增加甲苯對混合菌株分解乙酸乙酯的影響 • 微生物固定化後對有機物分解的影響 • 由圖4(a)、2(b)的比較，得知在微生物固定化之後，分解固定量乙酸乙酯所需的時間，並不太會隨甲苯添加量的增加而增加。 • 菌株B5和F1在固定化之後，可以有效地改善其原先在懸浮狀態下分解時間嚴重落後的現象。

3.5 固定添加8l乙酸乙酯而按比例增加甲苯對混合菌株分解乙酸乙酯的影響 • 懸浮菌株降解>95%乙酸乙酯所需時間 • 各獨立菌株在固定量的乙酸乙酯下，些微因為甲苯的添加量而增加，而需要更多的時間來分解乙酸乙酯，可見得增加固定量的乙酸乙酯也會造成微生物生理機能上的負荷而無法作適當的調適。 • 混合菌株B5和F1會因甲苯的添加量增加而增加分解乙酸乙酯的時間，此時在較高的乙酸乙酯添加量，其受到的影響加巨。 • 這說明在高負荷時，乙酸乙酯基質抑制的效應會漸漸因為甲苯添加量的增加而存在。 • 另外，菌株AC6和B5的組合，對於乙酸乙酯的分解並沒有助益。這事實菌株AC6和B5互助的現象僅止於對於甲苯的分解不同。表6　在懸浮狀態下，以固定乙酸乙酯添加量（8 µl）下增加甲苯添加量（不同T/E比)，使用單一或任兩組菌株組合(strains AC6 & B5、strains B5 & F1及strains AC6 & F1) 而能達到95%乙酸乙酯去除率所需的時間

圖5、在固定乙酸乙酯添加量 (8-µl) 下改變T/E比，各種菌群以懸浮 (a) 的或是固定化(b) 的型式來分解乙酸乙酯時，去除率達95%所需的時間：菌群AC6 & B5 (square )、菌群B5 & F1 (circle )及菌群AC6 & F1 (triangle )：菌群AC6 & B5 ( )、菌群B5 & F1 ( )及菌群AC6 & F1 ( )。 3.5 固定添加8l乙酸乙酯而按比例增加甲苯對混合菌株分解乙酸乙酯的影響 • 微生物固定化後對有機物分解的影響 • 由圖5(a)、2(b)的比較，得知在微生物固定化之後，分解固定量乙酸乙酯所需的時間，亦開始隨甲苯進料量的增加而些微增加，明顯地受到較高的乙酸乙酯添加量所影響。 • 菌株B5和F1所需要的時間與菌株AC6和F1的組合，在固定化之後，可以有效地改善其原先在懸浮狀態下分解時間嚴重或些微落後的現象。

4.0 評估展望 • 論文結論 • 以T/E比為基準，同步增加甲苯和乙酸乙酯的負荷，或者在固定甲苯添加量下增加乙酸乙酯的添加量，及固定不同的乙酸乙酯添加量下增加甲苯的添加量，各個實驗中皆發現混合菌株有明顯的族群抑制現象存在，在經固定化後有明顯的改善。 • 在菌株的組合上，發現菌株AC6和B5仍然存在些微生態學上互助的效應，但沒有菌株AC6和F1效果來得好，但後者會因為甲苯的添加量的增加而失去優勢。 • 菌株B5和F1，有明顯的族群抑制現象，不論是同比例增加甲苯或乙酸乙酯的添加量或是增減T/E比，皆是如此；幸而，使用固定化技術可以有效地解決該問題。

4.0 評估展望 • 計畫結論 • 本計畫於去年十二月底才完成重要設備的採購驗收。因此，很多如基因鑑定與動力現象模擬的數據仍在進行中，針對本計畫第一年度的執行成效，仍具信心，相信未來第二年度，更可以看出本計畫前一年度的整體成效。 • 基於本年度的經驗，未來第二年度與第三年度的採購，應提早進行，尤其是重要裝備，必須事先採購，並且試車。 • 對於本計畫建立針對微生物族群結構的分析技術，未來有助於本校對於自身環境衛生的檢測分析，甚至擴及病源菌的檢測，都可以以此為基礎。

簡報結束 謝謝聆聽！

以 PU/PVA 包埋菌體顆粒於氣舉式反應器中處理含甲苯與乙酸乙酯廢氣之研究 第一年度：造成抑制現象的原因探討