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Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica PowerPoint PPT Presentation


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Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica. Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República. 7 de mayo de 2009. Bibliografía recomendada: Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15.

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Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica

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Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Fundamentos de

Espectrometría de Masa

Biológica

Matías Möller

Lab. Fisicoquímica Biológica

Instituto de Química Biológica

Facultad de Ciencias

Universidad de la República

7 de mayo de 2009


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Bibliografía recomendada:

Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed.

Cap. 15.

J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122.

Introduction to proteomics, Liebler, 2002.


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

1- Generalidades

2- MALDI-TOF

3- ESI-Q

4- Peptide Mass Fingerprinting y

tandem MS


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

1- Generalidades


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Técnica que permite la

separación y determinación de

la relación masa/carga de

iones gaseosos


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Espectrometría ≠ Espectroscopía

(Medición de un rango)

(implica absorción o

emisión de energía radiante)


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Espectrometría de masa de Biomoléculas

  • Determinación de masa y/o composición:

  • Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares

  • Polisacáridos, oligosacáridos

  • Lípidos  Lipidoma

  • Fragmentos de ácidos nucleicos

    Técnica muy sensible:

    puede analizar mg-ng (y menos) de material


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Espectrometría de masa de Proteínas

  • Determinación de masa y/o composición

  • Identificación por comparación con bases de datos

    (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos

  • Modificaciones postraduccionales

  • Complejos Supramoleculares:

    Interacción entre proteínas

    Interacción con compuestos de bajo PM

  • Plegamiento

  • Niveles de expresión/modificación posttraduccional


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Gel 2D de

hígado humano

http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

cyt C ~ 12000 Da


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Espectrometría de masa biológica

Lisozima


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

PM(péptido) = 1162 Da

Modo positivo

Modo negativo

m = +1 +23 +39

-1


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Los Iones son importantes

En el proceso de Ionización se forman diferentes

tipos de iones  cambios en m/z:

[M+H]+o[M-H]-

De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos,

fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+)

[M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]-

De la unión de iones especialmente a moléculas que

contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da)

[M]*+, [M]*-

(oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Espectrómetro de masa

Muestra

Entrada:

Volatilización/

Ionización

Analizador

de masas

Detector

MALDI

ESI

TOF

Cuadrupolo

Tampa de Iones

FTICR

Sector Magnético

Alto

Vacío


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

¿Cómo volatilizar una proteína?

Premio Nobel de Química 2002

Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization

Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization

Sin Premio:

Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI

(como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Espectrómetros de masa

(configuraciones para grandes biomoléculas)

MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization-

Time of Flight

ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole

ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap

ESI-FTICR: Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

2- MALDI-TOF


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Ionización por MALDI:

(Matrix assisted Laser desorption/ionization)

Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe

energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación

de la muestra:

La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando

la proteína cargada hacia la entrada del analizador.

El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+.

Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante

un campo eléctrico


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Matriz


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MALDI

Desorción/Ionización por Laser

Asistida por Matriz


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo

a su “tiempo de vuelo”(t).

t  (m/z)1/2

las partículas con menor m/z llegan antes al detector

No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y

tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son

acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una

energía cinética:

Ek = zeEs

donde s es la distancia de la región de la fuente.

Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa

ningún campo. los iones con igual carga tienen la misma Ek,

½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½

t = D/v = (m/2zeEs)½D

 m/z = 2eEs(t/D)2


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Sin E, iones a la deriva

E

+ -

Fig. Separación por TOF

+

+

+

+

D

s

Detector

Fuente

½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½

t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Tubo de vuelo

4-25 kV

Detector

Carlos Cerveñansky


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Tubo de vuelo

4-25 kV

Detector

Carlos Cerveñansky


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MALDI-TOF


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MALDI-TOF

Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MALDI-TOF


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

1672.92

Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM)

Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM)

Resolución en MALDI-TOF

Carlos Cerveñansky


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Los Isótopos son importantes

  • Los espectrómetros de masa diferencian entre isótopos

  • Pesos moleculares: Unidades de masa atómica (amu),

  • se basa en una escala relativa al 126C = 12 amu

  • 1 amu = 1 dalton = 1.66054 x 10-24 g

    Abundancia isotópica:

  • 12C12.000098.90 %

  • 13C13.00341.10 %


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Carlos Cerveñansky


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Carlos Cerveñansky


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005]

% Intensity

2xC13

Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina.

(aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 ml de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM)

2093

100

C13

90

80

70

60

C12

50

40

30

20

10

0

0

5725

5729

5733

5737

5741

5745

Mass (m/z)

Carlos Cerveñansky


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MALDI-TOF


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

3- ESI-MS


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

ESI-Q

ElectroSpray Ionization - Quadrupole

Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar

sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2

(gas secante).

El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas

cargadas (spray), donde el solvente termina de evaporarse

y las proteínas cargadas viajan hacia el analizador

El Analizador es un “filtro de masa” cuadrupolo


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

ESI

N2


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

ESI


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

ESI-Q

Al analizador de masas de Cuadrupolo se le llama

“Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de

un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son

neutralizados y eliminados.

Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible

variar la m/z y realizar un barrido espectral

Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de

electrodos del filtro de masas

Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, no tienen

muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

ESI-Q


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

ESI-Q


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

ESI-Q


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

14+

13+

12+

11+

11+

10+

10+

9+

9+

ESI-MS

Deconvolución del espectro

FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

14+

13+

12+

11+

11+

10+

10+

9+

9+

ESI-MS

Deconvolución del espectro

FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

(n+1)+

n+

ESI-MS

Deconvolución del espectro

x1 = (M+n)/n

x2 = (M+n+1)/(n+1)

 n = (x2-1)/(x1-x2)

n = (1084.1-1) / 72.1 = 15

M = (1156.2 x 15) -15 = 17328


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

ESI-MS

Deconvolución del espectro

Mioglobina de caballo


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

ESI-MS

Deconvolución del espectro

Bajo PM

Alto PM


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

ESI-MS


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Comparación ESI-MS y MALDI-TOF

Cyt C


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

Comparación


Identificaci n de prote nas

Identificación de proteínas

Peptide mass fingerprinting


Identificaci n de prote nas1

Identificación de proteínas


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MS/MS

Espectrometría en Tándem:

Secuenciación de péptidos


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MS/MS: Espectrometría en Tándem

Seleccionar uno de los iones de la muestra, fragmentarlo

y estudiar la formación de iones “hijos”

mp+ md+ + mn0

Identificación de moléculas

Secuenciación de péptidos “al vuelo”

Modificaciones posttraduccionales


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MS/MS: Espectrometría en Tandem

ESI-Q

Q1Q2Q3: Triple Cuadrupolo. Q1 y Q3 separan iones moleculares,

mientras Q2 sirve de cámara de colisión: Se introduce un gas

para que los iones acelerados choquen y se fragmenten

CID: Collision Induced Dissociation

MALDI-TOF

Iones moleculares que se fragmentan durante el vuelo llegan

juntos al “reflector” y pueden ser analizados por el mismo.

PSD: Post Source Decay


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

1 péptido

seleccionado para MS/MS

+

+

MS/MS

+

+

+

+

MS/MS

Secuenciación peptídica

Mezcla de péptidos

Espectro MS/MS:

masa de los fragmentos

Espectro MS

Carlos Cerveñansky


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Espectrometría de masa

MS/MS: Espectrometría en Tandem

Fragmentación peptídica


Fundamentos de espectrometr a de masa biol gica

Carlos Cerveñansky


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