DNR IR RNR MOLEKULINĖ STRUKTŪRA

1. DNR IR RNR MOLEKULINĖ STRUKTŪRA

2. ĮVADAS • Genetikos kursą pradėsime nuo molekulinės genetikos • Molekulinė genetika tyrinėja DNR struktūrą ir funkcijas molekulių lygmenyje • Pastarųjų metų mokslo pasiekimai, tobulinant tyrimo metodus ir kuriant naujas koncepcijas, labai išplėtė molekulinės genetikos žinias • Šis progresas palietė ne tik molekulinę, tačiau ir požymių perdavimo bei populiacijų genetikas • Didžiaja dalimi genetikos žinios yra sukauptos tiriant DNR ir RNR 2-2

3. 2.1 DNR KAIP GENETINĖ MEDŽIAGA • Savo funkciją genetinė medžiaga atlieka tik tada, kai ji pasižymi tam tikromis savybėmis • 1. Informacija: Ji privalo turėti informaciją, būtiną visam organizmui sukurti • 2. Paveldėjimu: Ji privalo būti perduodama iš tėvų vaikams • 3. Replikacija: Ji turi būti kopijuojama • Tada ji gali būti perduodama iš tėvų vaikams • 4. Kintamumu: Ji privalo gebėti keistis • Toks kintamumas užtikrina plačiai stebima fenotpinę variaciją kiekvienos rūšies viduje 2-3

4. 2.1 DNR KAIP GENETINĖ MEDŽIAGA • Daugelio genetikų, tarp jų ir Mendelio, duomenys atitiko šias keturias savybes • Tačiau genetinės medžiagos cheminė prigimtis negalėjo būti nustatyta vien tik kryžminant organizmus • Iš tikrųjų, DNR kaip genetinės medžiagos identifikavimas pareikalavo naujoviško požiūrio į eksperimentinę biologiją 2-4

5. Fredericko Griffithoeksperimentai su Streptococcus pneumoniae • Griffithastyrė bakteriją (Diplococcus pneumoniae), kuri dabar vadinama Streptococcus pneumoniae • Yra aptinkami du S. pneumoniaekamienai • S  Smooth (lygus) • Sekretuoja polisacharidinę kapsulę • Ši apsaugo bakteriją nuo gyvūnų imuninės sistemos • Auginamos ant kietos terpės suformuoja lygias kolonijas • R  Rough (šiurkštus) • Nesugeba sekretuoti kapsulės • Kolonijų kraštai nelygūs 2-5

6. Be to, dviejų S kamienų kapsulės gali reikšmingai skirtis pagal savo cheminę sudėtį • Retos mutacijos gali paversti S kamienus R kamienais ir atvirkščiai • Tačiau mutacjos nekeičia kamienų tipų 2-6

7. 1928 m. Griffithas atliko eksperimentus naudodamas du S. pneumoniae kamienus: IIIS tipo ir IIR tipo • 1. Pelėms suleistos gyvos IIIS tipo bakterijos • Pelės žuvo • IIIS tipo bakterijos buvo išskirtos iš pelių kraujo • 2. Pelėms suleistos gyvos IIR tipo bakterijos • Pelės išgyveno • Iš pelių kraujo nebuvo išskirta gyvų bakterijų • 3. Pelėms suleistos aukšta temperatūra užmuštos IIIS tipo bakterijos • Pelės išgyveno • Iš pelių kraujo nebuvo išskirta gyvų bakterijų • 4. Pelėms suleistos gyvos IIR tipo aukšta temperatūra užmuštos IIIS tipo bakterijos • Pelės žuvo • IIIS tipo bakterijos buvo išskirtos iš pelių kraujo 2-7

8. 2-8

9. Griffithasnusprendė, kad kažkokia medžiaga iš žuvusių IIIS tipo bakterijų transformavo IIR tipo bakterijas į IIIS tipą • Jis pavadino šį procesą transformacija • Medžiaga, kuri tai padarė, buvo pavadinta transformuojančiąja priežastimi • Griffithui nepavyko nustatyti, kokia tai medžiaga • Transformuojančiosios priežasties prigimtis buvo nustatyta gerokai vėliau, naudojant įvairius biocheminius metodus 2-9

10. Avery, MacLeod ir McCarty eksperimentai • Avery, MacLeod ir McCarty suprato, kad Griffithotyrimų rezultatai gali būti panaudoti genetinei medžiagai nustatyti • Jie atliko savo eksperimentus penktame XX a. dešimtmetyje • Tuo metu jau buvo žinoma, kad pagrindiniai ląstelių makrokomponentai yra DNR, RNR, baltymai ir angliavandeniai • Iš IIIS tipo bakterijų jie paruošė ląstelių ekstraktus, turinčius kiekvieną iš šių makromolekulių • Tiktai ekstraktai, turintys išgrynintą DNR, galėjo transformuoti IIR tipo bakterijas į IIIS tipo bakterijas 2-10

11. Avery et altaip pat atliko ir kitą eksperimentą • Jo reikėjo norint įrodyti, kad būtent DNR, o ne koks nors kitas ekstrakto komponentas (RNRar baltymas) yra genetinė medžiaga 2-11

12. Hershey ir Chase eksperimentai su bakteriofagu T2 • 1952 m. Alfred Hershey ir Marsha Chase pateikė papildomų įrodymų, kad genetinė medžiaga yra DNR Kapsidės viduje • Jie tyrė bakteriofagą T2 • Jo sandara yra palyginti paprasta, nes jį sudaro tik dvi makromolekulės • DNRir baltymai Padaryti iš baltymo 2-12

13. Bakteriofago T2 gyvenimo ciklas 2-13

14. Hershey and Chase eksperimentų santrauka: • Naudojo radioizotopus, norėdami atskirti DNR nuo baltymų • 32P specifiškai pažymi DNR • 35S specifiškai pažymi baltymus • Radioaktyviai pažymėtais fagais buvo užkrečiamos neradioaktyviosEscherichia coliląstelės • Po tam tikro laiko, reikalingo infekcijai įvykti, likusios fagų dalelės buvo pašalinamos • => Fagų liekanos ir E. coliląstelės buvo atskiriamos • Radioaktyvumas buvo vertinamas scintiliaciniu skaitikliu 2-14

15. Hipotezė • Tik fago genetinė medžiaga yra injekuojama į bakterijas • Radioaktyvi žymė turi parodyti, ar tai yra baltymas, ar DNR 2-15

16. Rezultatai 2-16

17. Dauguma radioaktyvios sieros rasta supernatante Duomenų interpretacija Tačiau tik maža dalis radioaktyvaus fosforo • Šie rezultatai rodo, kad infekcijos metu fago DNR buvo injekuota į bakterijų citoplazmą • Tai yra tas rezultatas, kurio buvo galima tikėtis, jei būtent DNR yra genetinė medžiaga 2-17

18. Kai kuriuose virusuose genetinės medžiagos funkciją atlieka RNR • 1956 m. A. Gierer ir G. Schramm išskyrė RNR iš augalų viruso – tabako mozaikos viruso (TMV) • Išvalyta RNR sukeldavo tas pačias pažaidas, kaip ir intaktinis TMV • Taigi, šių virusų genomą sudaro RNR • Dabar aptikta nemažai RNR virusų 2-18

19. DNR ir RNR virusų pavyzdžiai 2-19

20. 2.2 NUKLEINO RŪGŠČIŲ STRUKTŪRA • DNR ir RNR yra stambios makromolekulės, susidarančios iš keleto lygmenų struktūrų • 1. Nukleotidaisudaro pasikartojančius vienetus • 2. Nukleotidai susijungia sudarydami grandinę • 3. Dvi grandinės sąveikauja sudarydamos dvigubą spiralę • 4. Dviguba spiralė susisuka, susilanksto ir sąveikauja su baltymais, sudarydama 3-D struktūras, formuojančias chromosomas 2-20

21. 2-21

22. Nukleotidai • Nukleotidaiyra pasikartojantys DNR ir RNR struktūriniai vienetai • Juos sudaro trys komponentai • Fosfatinė grupė • Pentozė (cukrus) • Azotinė bazė 2-22

23. 2-23

24. Nukleotidų, randamų (a) DNRir (b) RNR, struktūra • Šie atomai randami laisvuose nukleotiduose • Tačiau jie yra pašalinami, kai nukleotidai jungiasi tarpusavyje, sudarydami DNR ir RNR grandines A, G, C arT A, G, C ar U Pasikartojantis dezoksiribonukleino rūgšties (DNR) elementas Pasikartojantis ribonukleino rūgšties (RNR) elementas 2-24

25. Bazė + cukrus nukleozidas • Pavyzdžiai • Adeninas + ribozė = adenozinas • Adeninas + dezoksiribozė = dezoksiadenozinas • Bazė + cukrus + fosfatas(i) nukleotidas • Pavyzdžiai • Adenozino monofosfatas (AMP) • Adenozino difosfatas (ADP) • Adenozino trifosfatas (ATP) 2-25

26. Bazė visada prisijungia čia Fosfatai prisijungia čia 2-26

27. Nukleotidai kovalentiškai susijungia per fosfodiesterinęjungtį • Fosfatas jungia vieno nukleotido 5’ anglies atomą su kito nukleotido 3’ anglies atomu • Tuo būdu grandinė turi kryptį • Iš 5’ į 3’ • Fosforo rūgšties liekanos ir cukrūs sudaro nukleino rūgšties grandinės karkasą • Bazės kyšo iš karkaso 2-27

28. 2-28

29. DNR struktūra buvo išaiškinta remiantis keliais esminiais rezultatais • 1953 m. James Watson ir Francis Crick nustatė, kad DNR sudaro dviguba spiralė, kurioje nukleotidai sąveikauja tarpusavyje pagal tam tikras taisykles • Tačiau šio atradimo mokslinius pagrindus sukūrė kiti mokslininkai • Linus Pauling • Rosalind Franklin ir Maurice Wilkins • Erwin Chargaff 2-29

30. Linusas Paulingas • Penktajame XX a. dešimtmetyje jis nustatė, kad tam tikri baltymų regionai gali susilankstyti į antrinę struktūrą • a-spiralė • Šiai struktūrai išaiškinti, jis pagamino modeli, sudarytą iš rutuliukų ir lazdelių 2-30

31. Rosalind Franklin • Dirbo vienoje laboratorijoe su Mauricu Wilkinsu • Naudojo Rentgeno spindulių difrakciją drėgnų DNR siūlų struktūrai tirti Difrakcinį vaizdą galima interpretuoti, naudojant matematinio modeliavimo metodus. Tai gali suteikti informacijos apie tiriamos molekulės struktūrą 2-31

32. Rosalind Franklin • Rentgeno difrakcijos metodais ji pasiekė gana didelės pažangos, tyrinėjant DNR struktūrą • Difrakciniai vaizdai atspindėjo kai kurias pagrindines DNR savybes • Spiralinė struktūra • Daugiau nei viena grandinė • 10 bazių porų tenka vienai pilnai spiralės vijai 2-32

33. Erwino Chargaffo eksperimentai • Chargaffas pirmasis panaudojo daugelį nukleino rūgščių išskyrimo iš gyvų ląstelių, išgryninimo ir matavimo biocheminių metodų • Tuo metu jau buvo žinoma, kad DNR sudaro keturios bazės: A, G, C ir T • Bazių sudėties analizė gali atskleisti svarbias DNR struktūros ypatybes 2-33

34. 2-34

35. 2-35

36. Chargaffo tyrimų duomenys: bazių procentinis santykis skirtingų organizmų DNR 2-36

37. Rezultatų interpretavimas • Duomenys, pateikti lentelėje, sudaro tik nedidelę dalį visų rezultatų, gautų Chargaffo • Iš rezultatų akivaizdžiai matyti, kad • Adenino procentas = timino procentui • Citozino procentas = guanino procentui • Šis dėsningumas vadinamas Chargaffotaisykle • Tai buvo vienas pagrindinių atspirties taškų, kuriuos panaudojo Watsonasir Crickas DNR struktūrai išaiškinti 2-37

38. Watsonasir Crickas • Būdami susipažinę su visais šiais tyrimų rezultatais, Watsonas ir Crickaspasiryžo išsiaiškinti DNR struktūrą • Jie bandė pagaminti DNR modelį iš rutuliukų ir lazdelių, kuriam būtų būdingi visi žinomi eksperimentiniai DNR bruožai • Esminis klausimas buvo kaip dvi (ar daugiau) grandinių sąveikauja tarpusavyje • Pirminė idėja buvo, kad grandinės sąveikauja per fosfato-Mg++sąsiuvas 2-38

39. Ši hipotezė, žinoma, buvo neteisinga! 2-39

40. Watsonasir Crickas • Tada jie sukūrė modelį, kuriame • Fosfodezoksiribozinis karkasas buvo išorėje • Bazės buvo projektuojamos viena priešais kitą • Pradžioje jie manė, kad vandenilinės jungtys jungia identiškas bazes, esančias priešingose grandinėse • t.y., A su A, T su T, C su C, and G su G • Tačiau modeliavimas parodė, kad ir šis modelis nėra teisingas 2-40

41. Watsonasir Crickas • Tik tada jie suprato, kad vandenilinės jungtys susidaro tarp A ir T bei tarp C ir G • Taigi, jie pagamino modelį, kuriame A sąveikavo su T, o G – su C • Šis modelis jau atitiko visus tuo metu žinomus duomenis apie DNR struktūrą 2-41

42. Watsonasir Crickas • Watsonas, Crickasir Wilkinsas 1962 m. už DNR struktūros išaiškinimą gavo Nobeliopremiją • Deja, Rosalind Franklin mirė 1958, o Nobelio premijos nėra skiriamos po mirties. 2-42

43. Dviguba DNR spiralė • Pagrindinės struktūros ypatybės • Dvi grandinės yra susivijusios apie centrinę ašį • Vieną pilną apviją sudaro 10 bazių • Abidvi grandinės yra antiparalelios • Vienos kryptis yra nuo 5’ į 3’, o kitos - nuo 3’ į 5’ • Spiralė yra dešninė • Kai ji vijasi nuo jūsų, spiralė sukasi pagal laikrodžio rodyklę 2-43

44. Dviguba DNR spiralė • Pagrindinės struktūros ypatybės • DNR struktūra yra stabilizuojama • 1. Tarp komplementarių bazių susidaro vandenilinės jungtys • A jungiasi su T per dvi vandenilines jungtis • C jungiasi su G per tris vandenilines jungtis • 2. Bazių stekingas • DNR struktūroje bazės yra orientuotos taip, kad jų plokščiosios dalys “žiūri” viena į kitą. Esant tokiai orientacijai, tarp bazių susidaro stekingo jėgos, kurios papildomai stabilizuoja DNR struktūrą 2-44

45. Pagrindinės savybės • Dvi DNR grandinės formuoja • dešninę dvigubą spiralę • Bazės priešingose grandinėse • jungiasi vandenilinėmis • jungtimis pagal A/T ir G/C • taisyklę • DNR grandinės yra anti- • paralelios pagal savo • 5’3’ kryptį • Kiekvienos grandinės • pilną 360° apviją • sudaro 10 nukleotidų 2-45

46. Dviguba DNR spiralė • Pagrindinės struktūros ypatybės • Spiralės paviršiuje susiformuoja du asimetriškigrioveliai • 1. Didysis griovelis • 2. Mažasis griovelis • Kai kurie baltymai gali jungtis prie šių griovelių • Tuo būdu jie gali sąveikauti su tam tikromis nukleotidų sekomis 2-46

47. 2-47

48. DNRgali susiformuoti į kelių tipų dvigubas spirales • DNR dviguba spiralė gali sudaryti skirtingos konformacijos antrines struktūras • Dominuojanti forma, randama gyvose ląstelėse yra B-DNR • Esant tan tikroms in vitrosąlygoms, gali formuotis A-DNRirZ-DNRdvigubos spiralės 2-48

49. A-DNR • Dešninė spiralė • Vienoje vijoje 11 bp • Susiformuoja esant žemai drėgmei • Nėra aiškių įrodymų apie jos biologinę svarbą • Z-DNR • Kairinė spiralė • Vienoje vijoje 12 bp • Formavimą skatina • Esant didelei druskų koncentracijai - GC-turtingos sekos • Esant mažai druskų koncentracija – citozino metilinimas • Tokia konformacija gali būti svarbi transkripcijai ir rekombinacijai, bent jau mielių ląstelėse 2-49

50. Bazės pakrypusios centrinės ašies atžvilgiu Bazės pakrypusios centrinės ašies atžvilgiu Bazės santykinai statmenos centrinei ašiai Fosfofdezoksiribozinis karkasas išsidėstęs zigzagiškai 9-50