磷酸果糖镁中乙醇限量检查 —— 陈金晶张彩霞

磷酸果糖镁中乙醇限量检查 —— 陈金晶张彩霞

实验背景 • 实验目的 • 实验原理 • 实验方法 • 实验结果 • 讨论心得

实验背景 果糖磷酸镁（简称FDP-Mg）为一水合物，是新一代抗心肌缺血类药物。FDP-Mg为FDP和Mg的合成药，据报道，FDP-Mg对心肌缺血性损伤具有保护作用，其疗效优于果糖磷酸钠（FDP-Na）和硫酸镁。可望开发成为新一代抗心肌缺血类药物。

实验目的 • 熟悉顶空气相色谱仪的工作原理 • 学会用气相色谱法检查药品中的残留溶剂(乙醇) • 掌握内标法、标准加入法判断残留溶剂是否超过药典规定的限度的方法

实验原理 • 药品中的残留溶剂是指在合成原料药，辅料或制剂生产的过程中使用的，但在工艺中未能完全除去的有机溶剂。按照05版《中国药典》规定，乙醇属于第三类溶剂，其限度要求为0.5％。根据药典规定，残留溶剂的检查方法为GC。

实验原理 • 气相色谱的进样方式可分为溶液直接进样或顶空进样,本实验采用顶空进样法。顶空进样适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。 • 顶空进样根据取样和进样的方式不同分为静态和动态.本实验采用静态的方法。静态顶空:将样品溶液密封在一个容器中在一定温度下加热一段时间使气液两相达到平衡,然后取气相部分进入GC分析.

实验原理 • 外标法限度检查：根据药典残留溶剂限度检查的规定，供试品所得被测溶剂峰面积不得大于对照品溶液相应的峰面积。 • 内标法限度检查：供试品溶液待测溶剂峰面积与内标峰物质面积之比不得大于对照品溶液相应比值。 • 标准加入法当供试品和对照品处于不完全相同的基质中，基质可能对实验结果产生影响。采用标准加入法可以消除基质效应的影响。当其它方法与标准加入法结果不一致时，以标准加入法为准。限度检查：（A1/As1）<（A2/As2）-（A1/As1）

实验仪器 Agilent 7694E 顶空仪 Agilent GC-6890N 顶空进样气相色谱仪

实验方法 顶空进样条件顶空瓶温度（VIAL）：85℃ 定量圈温度（LOOP）：95℃ 传送带温度（TR.LINE）：105℃ 气相色谱仪工作时间（GC CYCLE TIME）：20min 顶空瓶加热平衡时间（VIAL EQ.TIME）：30min 顶空瓶加压时间（PRESSURIZ.TIME）：0.2min 定量圈定量时间（LOOP FILL TIME）：0.2min 定量圈平衡时间（LOOP EQ.TIME）：0.05min 进样时间（INJECT TIME）：1.00min

实验方法 色谱条件色谱柱型号:Agilent 19091N-113 HP-INNOWWax Polyethylene Glycol 毛细管柱：30.0m×320μm×0.25μm 载气：氮气（流速0.9ml/min，分流比10：1）氢气45ml/min 空气450ml/min 气化室温度： 200℃ 柱温： 60℃ 检测室温度： 250℃ （FID）

实验方法 • 对照品溶液：分别精密称量取乙醇2.5g和正丙醇2.5g,置100ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,作为贮备液。精密量取各贮备液2mL,置同一100mL量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,精密量取4mL置顶空瓶中,密封瓶口,作为对照品溶液。（对照品溶液中乙醇为500μg/ml，内标正丙醇为500μg/ml） • 定位溶液：精密量取上述乙醇贮备液2ml置100mL量瓶中，加水稀释，定容至刻度，摇匀（乙醇为500μg/ml）。

实验方法 • 供试品溶液：溶液（1）：精密称取果糖磷酸钠样品（约2.5g）,置25ml量瓶中,加适量水使之溶解，摇匀。精密量取内标正丙醇贮备液1ml（相当于25mg正丙醇）,加水稀释至刻度,摇匀，定容。果糖磷酸镁0.1g/ml,正丙醇500μg/ml 溶液（2）：精密称取果糖磷酸钠样品（约2.5g）,置25ml量瓶中,加适量水使之溶解，摇匀。精密量取内标正丙醇贮备液（相当于25mg正丙醇）和乙醇贮备液各1ml，摇匀，定容。果糖磷酸镁0.1g/ml,正丙醇500μg/ml，乙醇 500μg/ml

实验方法 • 系统适用性试验 • 乙醇限度检查 • 最低检出限 • 回收率

系统适用性试验 操作：取上述对照品溶液4mL，置于20mL顶空进样瓶中，在2.1项色谱条件下进样分析。重复进样5次。结果：在上述色谱条件下，乙醇的保留时间为4.69min，正丙醇的保留时间为6.30min。乙醇的色谱峰的对称因子为0.86，正丙醇的色谱峰的对称因子为0.94。乙醇色谱峰的理论塔板数为91403，正丙醇色谱峰的理论塔板数为754701，乙醇和正丙醇的分离度R为34.8，乙醇和内标物正丙醇峰面积之比重复性较好，RSD%为0.56%。

乙醇限度检查 • 内标法：取对照品溶液4ml置于20mL顶空进样瓶中，在2.1项色谱条件下进样分析，记录色谱图，重复进样3次。同法对供试品溶液（1）进行进样分析。 • 标准加入法：取供试品溶液（1）4mL置于20mL顶空进样瓶中，在2.1项色谱条件下进样分析，记录色谱图，重复进样3次。同法对供试品溶液（2）进行进样分析，重复进样3次。

内标法 结论：（Ax/As)供试品=0.887>(Ar/As) 乙醇含量超过限度

标准加入法 结论：（A2/As2）-（A1/As1） < （A1/As1），乙醇含量超过限度

检测限 检测限系指试样中被测物能被检出的最低量。实验中我们用信噪比法，这是一种能显示基线噪声的分析方法，一般以S/N=3或者2时相应浓度或注入仪器的量确定LOD的值。方法：先将对照品乙醇溶液（500ug/ml）先稀释至5ug/ml，初次考察，根据检测所得图谱，相应地调整浓度；结果：当进样浓度为0.33μg/ml时，信噪比S/N=4.6 。

回收率 方法：精密称取磷酸磷酸果糖镁粉末（约0.4g）共12份分别置于顶空进样瓶中，按下表加入不同浓度（每个浓度3份）的乙醇溶液4ml,溶解，摇匀。在2.1项色谱条件下进样分析，记录色谱图。分别另取上述不同溶液的乙醇溶液，进样分析。待测溶液乙醇峰面积-本底溶液中乙醇的峰面积乙醇溶液的峰面积回收率= *100% 结果：

讨论 • 果糖二磷酸镁配制成0.1g/ml溶液后呈淡黄色，经顶空加热30min后颜色加深。这是因为果糖二磷酸镁本身是个多羟基化合物，极易吸潮，其所含的磷酸酯键吸收空气中的水分而发生水解反应，水解产物为游离磷酸盐、6-磷酸果糖和果糖。在顶空85℃加热的条件下，水解反应更容易发生。

讨论实验结果显示，乙醇含量超过药典规定的限度，可能原因如下： • 磷酸果糖镁在制备过程中残留溶剂提出不充分 • 未知杂质或其挥发热降解物与待测物的保留值相同，即共出峰物质的干扰 • 热降解产物与待测物的结构相似

讨论 • 在进行药物中残留有机溶剂检查时，应根据供试品中残留溶剂的沸点选择顶空温度，同时也要兼顾供试品的热分解特性，尽量避免供试品中产生的挥发性热分解产物对测定的干扰。在设计实验方案时，我们参考了文献，选择了顶空加热温度为85℃。根据乙醇的沸点为78℃，正丙醇沸点97℃，乙醇、水、正丙醇三者能共沸，合适的顶空加热温度可选择在75℃左右，而我们设定的85℃过高。该温度过高，可加速果糖磷酸镁的分解。

讨论 • 顶空时间一般为30～45分钟，以保证被加热溶液的气液两相有足够的时间达到平衡。顶空的时间也不宜过长，通常不应超过60分钟，否则可能使顶空瓶的气密性变差,导致定量准确性的降低。乙醇本身易挥发，因此可考虑将顶空加热时间缩短为15min。为验证这种改变是否可行，可以设计实验：一组是顶空加热时间为30min，另一组是顶空加热时间为15min。其余实验条件相同，考察实验结果的异同。若两组实验所得的峰面积、保留时间等基本一致，可以将顶空加热时间缩短为15min。

心得 • 模拟科研训练设计方案实验过程总结 • 规范的实验操作 • 培养严谨的实验态度 • 对实验保持开放和敏锐的态度

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磷酸果糖镁中乙醇限量检查 —— 陈金晶 张彩霞