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生物信息学软件及使用技巧. 内容概要. 一 . 生物信息学的概念 二 . 生物信息学软件的主要功能简介 分析和处理实验数据和公共数据，加快研究进度，缩短科研时间 提示、指导、替代实验操作，利用对实验数据的分析所得的结论设计下一阶段的实验 用计算机管理实验数据 寻找、预测新基因及预测其结构、功能 蛋白高级结构预测. 生物学软件部分常见功能使用技巧 PCR 引物设计 DNA 、蛋白质序列同源分析及进化树构建 Contig Express----DNA 序列片断拼接 DNA 模拟电泳 重要生物数据库简介 生物信息学服务. 一 . 生物信息学的概念.
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内容概要 一. 生物信息学的概念 二. 生物信息学软件的主要功能简介 • 分析和处理实验数据和公共数据，加快研究进度，缩短科研时间 • 提示、指导、替代实验操作，利用对实验数据的分析所得的结论设计下一阶段的实验 • 用计算机管理实验数据 • 寻找、预测新基因及预测其结构、功能 • 蛋白高级结构预测
生物学软件部分常见功能使用技巧 • PCR 引物设计 • DNA、蛋白质序列同源分析及进化树构建 • Contig Express----DNA 序列片断拼接 • DNA 模拟电泳 • 重要生物数据库简介 • 生物信息学服务
生物信息学的概念： 生物信息学是一门新兴的交叉学科，它将数学和计算机知识应用于生物学，以获取、加工、存储、分类、检索与分析生物大分子的信息，从而理解这些信息的生物学意义。
生物信息学软件主要功能 • 分析和处理实验数据和公共数据，加快研究进度，缩短科研时间 • 提示、指导、替代实验操作，利用对实验数据的分析所得的结论设计下一阶段的实验 • 实验数据的自动化管理 • 寻找、预测新基因及其结构、功能 • 蛋白质高级结构及功能预测（三维建模，目前研究的焦点和难点）
功能1. 分析和处理实验数据和公共数据，加快研究进度，缩短科研时间 • 核酸：序列同源性比较，分子进化树构建，结构信息分析，包括基元(Motif)、酶切点、重复片断、碱基组成和分布、开放阅读框（ORF），蛋白编码区（CDS）及外显子预测、RNA二级结构预测、DNA片段的拼接 • 蛋白：序列同源性比较，结构信息分析（包括Motif，限制酶切点，内部重复序列的查找，氨基酸残基组成及其亲水性及疏水性分析)，等电点及二级结构预测等等 • 本地序列与公共序列的联接，成果扩大
网上数据库的运用（成果扩大） • http://www.labonweb.com IRACE (基因拉长功能） • BLAST同源序列检索 • ENTREZ SYSTEM (集成信息检索系统)
DnaStar 之 Protean 对氨基酸的亲疏水性分析：helical wheel 图
功能2. 提示、指导、替代实验操作，利用对实验数据的分析所得的结论设计下一阶段的实验 用软件设计PCR引物，测序引物或杂交探针，设计克隆策略，构建载体，做模拟电泳实验，即模拟核酸内切酶或内肽酶对相应的底物分子切割后的电泳行为。蛋白跨膜区域分析，信号肽潜在断裂点预测。
功能3. 用计算机管理实验室数据及文献资料 • 实验室结果的储存，管理和申报工作 • 从网络数据库获得的序列文件（由ENTREZ集成检索系统所得的数据文件可以进入EndNote 或者Reference Manager 储存管理）或资料文献的管理 • 软件: EndNote， Reference Manager
功能4. 用计算机预测新基因及其结构和功能 • 对CDS（Coding Sequence）蛋白编码区的预测准确率已达到90%以上 • 对整个基因结构的预测存在一定难度 • PWM（位置权重矩阵）算法 由物化原理技术开发，侧重于找基因表达系统和核酸相互作用的位点。给信号序列各个位置每种可能出现的核苷酸分配一个分数，将各位置分数相加后得出该序列作为潜在作用位点的分数。
功能5.蛋白高级结构预测 • 该项技术算法十分复杂，尚未成熟。PDB及MMDB数据库目前仍然禁止收录软件预测出来的蛋白高级结构模型。 • X射线晶体学技术和多维核磁共振技术是当前人们认识蛋白高级结构的主要手段，但两种技术都有不足之处。前者要求必需得到高标准的蛋白晶体，后者对分子量大于3万的大蛋白不能测定。因此理论模拟和结构预测显得十分重要。 • 序列与结构关系的根源在于“蛋白质折叠的问题”，这是近期研究关注的焦点。
目前应用的蛋白质结构预测的算法 • 同源预测(一级结构决定高级结构) • 结构与结构相对比（DALI算法） • 当前最先进的结构预测方法： 结构类识别（fold recognition） 先建立一个已知的结构类数据库（fold library)，将待测序列“穿过”该数据库构成的座标，并根据事先确定的物理限制，逐个位置移动（threading， sequence-structure alignment) ，并用一个函数（sequence-structure fitness alignment) 判断序列与结构类的符合程度，找出未知序列在目标结构上的能量最优和构象最稳固的比对位置。对计算机要求很高。
引物设计的原则 首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，最后引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。
围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值(melting temperature)，ΔG值(internal stability)，引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin），错误引发位点（false priming site），引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。
引物设计要点 • 一般引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp，过长或过短都不合适。 • 引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。 • 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 • 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。
ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标，一般情况下，在Oligo 5.0软件的ΔG值窗口中，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间部分ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。分析其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合，因此5’端与中间段的ΔG值应较高，而3’端ΔG值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。
可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。 • 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。 • 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。
关于引物的自动搜索和评价分析 • 推荐使用自动搜索软件： Primer Premier 5.0 • 推荐使用引物评价软件： Oligo 5/6 > > > > > 实际操作示例
相似性与同源性 • 相似性是指一种很直接的数量关系，比如部分相同或相似的百分比或其它一些合适的度量。可进行自身局部比较。 如 Dot Plot (点阵序列比较) • 同源性指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断。 如 Alignment (同源性分析)
推荐软件 • 相似性分析 Peptool Lite • 同源性分析 Vector NTI Suit 6---AlignX > > > > > 实际操作示例
