A B ÉS T SEJTEK FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA 2. rész

1. A B ÉS T SEJTEK FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA 2. rész

2. Az antigén-specifikus T és B sejtek gyakorisága kicsi. A poliklonális T/B-sejt aktivációt kiváltó anyagok, és módszerek hasznosak lehetnek a sejtek funkcionális vizsgálatában.

3. Az antigénnel való aktiválás technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek gyakorisága kicsi Poliklonális T/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata

4. A T és B limfociták funkcionális aktivitásának mérése • 1. A T-és B sejtek poliklonálisaktivációja: A TCR vagy a BCRnem antigén-specifikus aktivációjával - lectinek-indukáltaaktiváció - α-IgM, α-CD3 vagy α-TCR ellenanyaggal, allogén T-sejt aktiváció (korai aktiváció: intracelluláris események vizsgálata) • 2. Az aktivációt követő T-és B-sejt válasz jellemzése aktivációs markerek (IL2R, integrinek) ellenanyag és/vagy citokin termelés (ELISA, bioassay) proliferatívválasz 3H-timidin beépülése CFSE fluoreszcencia feleződés sejtciklus vizsgálata 3. Az aktivált T , B sejtszám meghatározásaaz Ag-el való találkozás után ELISPOT intracelluláriscitokin festés tetramerfestés

5. Poliklonális B sejt aktivátorok hatásai

6. Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) ic Ca2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis - IC citometria • ELISA, ELISPOT • Bioassay Citokin szekréció - DNS tartalom - IN antigének Sejtciklusba lépés/apoptózis A limfocitákaktivációjának vizsgálata Sejtosztódás - 3H-timidin, CFSE, MTT Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul

7. Western Blot • Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben ellenanyagokat használnak • SDS-PAGE gél  a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján (átfedés is lehetséges) • Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik Protein minta Standard Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján Western blot Membrán SDS-PAGE

8. Western Blot • Segítségével egy adott fehérje jelenléte kimutatható a mintában • Az egymástól elektroforézissel elszeparált fehérjéket /Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)/, membránra transzferálják • Primerellenanyagot(monoklonálisvagy poliklonális) használnak a vizsgált fehérje kimutatásához (pl., anti-foszfotirozinat) • Enzimmel (pl. torma-peroxidáz) konjugált szekunder ellenanyag segítségével mutatják ki a primer ellenanyag kötődését

9. Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) ic Ca2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció -RT-PCR Citokin szintézis - IC citometria • ELISA, ELISPOT • Bioassay Citokin szekréció - DNS tartalom - IN antigének Sejtciklusba lépés/apoptózis A limfocitákaktivációjának vizsgálata Sejtosztódás - 3H-timidin, CFSE, MTT Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul

10. A génaktiváció vizsgálata Az aktiválódó génekről átíródó mRNS kimutatása. pl. citokingének aktivációja módszer: RT-PCR, QRT-PCR sejtek  RNS izolálás RNS  (Reverz transzkriptáz)  cDNS cDNS (PCR)  hossz és mennyiségmeghatározás RT-PCR: agaróz gél (denzitometria) QRT-PCR: fluoreszcens módszer (FRET)

11. Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) ic Ca2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis - IC citometria • ELISA, ELISPOT • Bioassay Citokin szekréció - DNS tartalom - IN antigének Sejtciklusba lépés/apoptózis A limfocitákaktivációjának vizsgálata Sejtosztódás - 3H-timidin, CFSE, MTT Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul

12. A termelődött citokinek intracelluláris kimutatása immunfluorimetriával jelzéssel ellátott citokin specifikus ellenanyag - a sejtmembránt detergenssel átjárhatóvá kell tenni - de előtte a sejteket fixálni kell, hogy ne essenek szét a detergenstől (pl. aldehides fixáció) • előzőleg a sejtek valamilyen, a sejttípusra jellemző antigént felismerő ellenanyaggal is megjelölhetők • („sejttípus marker” pl. CD4) citokinek

13. Eredmény: Meghatározható, hogy milyen sejttípusok termelték a citokineket! Érzékenysége elérheti a Western blotot (hűtött CCD mikroszkóp), de egyetlen sejt is elegendő lehet a vizsgálathoz.

14. Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) ic Ca2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis - IC citometria • ELISA, ELISPOT • Bioassay Citokin szekréció - DNS tartalom - IN antigének Sejtciklusba lépés/apoptózis A limfocitákaktivációjának vizsgálata Sejtosztódás - 3H-timidin, CFSE, MTT Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul

15. ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot • Elve hasonlít az ELISA-hoz. • Eredetileg az ellenanyagot szekretálóB-sejtszám meghatározása • Alkalmas egyéb effektor molekulák, pl. citokinek, kemokinek, granzimtemelő sejtek számának meghatározására is. • Alkalmas poliklonálisaktivátorokvagyantigénindukáltaaktivációtkövetőenazaktiválteffektorsejtekszámánakmeghatározására. • Érzékenység: 1/300000 sejt. • Sejtkultúra felhasználása, aszeptikus körülmények

16. ELISPOT - a capture ellenanyagok kitapasztása - blokkolás - a sejtek hozzáadása (aktiválás, inkubáció) - mosás - biotinnal konjugált másodlagos ellenanyag hozzáadása - avidin-enzim konjugátum ELISPOT lemez egy lukának felülnézete a képződött foltokkal - oldhatatlan kromogén szubsztrát hozzáadása citokin termlő sejt helyét mutató folt

17. leolvasása mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy “ELISPOT plate reader” segítségével (gyors, standardizálható spot szám és méret meghatározás)

18. Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) ic Ca2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis - IC citometria • ELISA, ELISPOT • Bioassay Citokin szekréció - DNS tartalom - IN antigének Sejtciklusba lépés/apoptózis A limfocitákaktivációjának vizsgálata Sejtosztódás - 3H-timidin, CFSE, MTT Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul

19. Bioassay Citokinekre érzékeny (citokin szenzitív), vagy csak citokinek jelenlétében túlélni/osztódni képes (citokin dependens) sejtvonalak segítségével a jelenlevő citokinek nagy érzékenységgel kimutathatók. pl. CTLL2 sejtek van IL-2 nincs IL-2 pl. Wehi-164 sejtek (fibrosarcoma) van TNF nincs TNF

20. A sejtek túlélését kolorimetriás eljárással (MTT assay) vagy az osztódásuk kimutatásával (lásd később) mérhetjük meg. citokinkoncentráció CTLL2 IL-2 Wehi 164 TNF MTT assay: (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromid, sárga tetrazol) MDH-enzimformazán (lila) Bizonytalanná teheti a kapott eredményt, hogy a sejtek nem biztos, hogy csak az adott citokinre reagálnak. Pl. a CTLL2 sejtvonalra az IL-4 hasonló hatást fejt ki, mint az IL-2.

22. Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) ic Ca2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis - IC citometria • ELISA, ELISPOT • Bioassay Citokin szekréció - DNS tartalom - IN antigének Sejtciklusba lépés/apoptózis A limfocitákaktivációjának vizsgálata Sejtosztódás - 3H-timidin, CFSE, MTT Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul

23. Sejt ciklus meghatározás „Sejt jelző” festék – a sejtbe diffundál. Az apoláros CFSE kovalensen kötődik az IC sejtfehérjékhez. Sejtosztódás során a mennyisége „hígul” a két utódsejtben. CFSE=carboxyfluoresceinsuccinimidylester sejtosztódások: 7 6 5 4 3 2 1 0

24. Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) ic Ca2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis - IC citometria • ELISA, ELISPOT • Bioassay Citokin szekréció - DNS tartalom - IN antigének Sejtciklusba lépés/apoptózis A limfocitákaktivációjának vizsgálata Sejtosztódás - 3H-timidin, CFSE, MTT Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul

25. ( + ) IL-2 IL-4 … MIP3β … IFN … ( - ) Citokinarray Sokféle citokin gyors meghatározására alkalmas A Western-blotblotolási lépését követő részére hasonlít különféle kikötött specifikus ellenanyagok „Lumineszcens elleanyag” keverék Vizsgálandó citokin tartalmú oldat Hátrány – a blot memrán nagy felülete miatt viszonylag nagy térfogatú/hígított mintára van szükség

26. CD40L és CD40L+SLAM kombinációval aktivált moDC citokintermelése A fluoreszcens gyöngyökkel elvégezhető variációjához klikkelj ide Réthi és mtsi. 2006

27. Citokinek alkalmazása különféle betegségekben