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Autoconservation des gamètes

Pr Catherine Poirot Assistance Publique-Hôpitaux de Paris Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière. Autoconservation des gamètes. Benoît Schubert Biologie de la Reproduction. AUTOCONSERVATION. Gamètes matures Spermatozoïdes Ovocytes Tissus gonadiques Ovaire Testicule.

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Autoconservation des gamètes

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Presentation Transcript

  1. Pr Catherine Poirot Assistance Publique-Hôpitaux de Paris Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière Autoconservation des gamètes Benoît Schubert Biologie de la Reproduction

  2. AUTOCONSERVATION • Gamètes matures • Spermatozoïdes • Ovocytes • Tissus gonadiques • Ovaire • Testicule

  3. Préserver la fertilité chez l’homme

  4. Historique 1776 - Spallanzani 1940 - Cryoprotecteur/ glycérol 1953 - Grossesse avec sperme congelé 1973 - CECOS en France (G. David) et - Centres d’AMP intra conjugale

  5. Techniques • Milieux de congélation • Glycérol • Agent cryoprotecteur pénétrant • Toxique pour la cellule  Contact à basse température  Durée de contact limitée  Ajout en 4 étapes (moins délétère qu’en 1 fois) • Mise en paillettes • Extrémités soudés

  6. Techniques • Congélation • cristallisation de l’eau extra-cellulaire • Concentration relative des solutés augmente • Déshydratation du spermatozoïde • Décongélation • Retrait du CP en plusieurs étapes • Concentration relative des solutés diminue(milieu hypo-osmotique) • Entrée d’eau dans le spermatozoïde • Puis sortie du Glycérol • Retour à un volume cellulaire normal

  7. Techniques • Congélation ‘lente’: en azote liquide • manuelle • Vapeurs d’azote : 8-30 minutes • Plonge dans azote liquide • Appareils programmables • Descente en température contrôlée • 5°C/minute  - 10°C • 10°C/minute  - 25°C • 25°C/minute  - 150°C • Décongélation rapide • -196°C  37°C (en qq minutes)

  8. Effets de la congélation sur les spermatozoïdes • Mobilité :  variable, environ 50% • Vitalité :  variable, environ 50% • Membrane : • Gonflements • Membrane plasmique • Gonflement acrosome  perte acrosome • Modification de la composition phospholipidique • Noyau • Chromosomes: pas de modification nb, structure, sex ratio • Etat de sur-condensation de la chromatine

  9. TRAITEMENTS A RISQUES Chirurgie à risque Pathologies à risque Vasectomie Dégradation caract. spermatiques Situation à risque … Cryptozoospermie Spz chirurgicaux Spz médicaux Spz après chirurgie Spz contexte viral … INDICATIONS PREVENTION AMP L’autoconservation doit être « systématiquement proposée » avant une « thérapeutique ou intervention potentiellement stérilisante » Et peut être proposée « avant ou au cours d’une AMP » Arrêté du 12/1/1999

  10. Spz chirurgicaux (2662) Avant Traitement (27182) AMP (9618) Avant vasectomie (7904) FEDERATION DES CECOS : 30 ans d’autoconservation

  11. FEDERATION DES CECOS : autoconservation maladie

  12. Pourcentage d’hommes pour lequel la congélation a pu être réalisée % Avant vasectomie 97% 91% 92% Avant traitement 65%

  13. Patient • Information autoconservation • Accueil du patient personnalisé • Consultation avec médecin biologiste • Méthodes • Masturbation • Recherche spermatozoïdes dans les urines • Urgence du traitement : permanence de l’accueil • Information des résultats de la congélation « Le patient doit être informé de la qualité du sperme et du nombre de paillettes » Arrêté du 12/1/1999

  14. SPZ Techniques : rares spermatozoïdes • Mise en paillettes classiques • ‘haute sécurité’ • Micro-gouttes • Guthauser et al., Andrologie 2002  Intérêts : augmenter le nombre de « doses », faciliter la recherche des spermatozoïdes prêts à l’emploi

  15. Identité Traçabilité Consentement Interrogation annuelle ‘Renouvelable sur demande écrite’ Utilisation Résultats Destruction « Seul le déposant peut demander la restitution ou la destruction » Sérologies HIV, VHB, VHC, Syphilis Paillette ‘haute sécurité’ Cuve de quarantaine Cuves spécifiques Accès locaux Sécurité azote Sécurité Patient Générale

  16. Problèmes • Age • Limites supérieures • Limites inférieures Puberté, possibilités de masturbation • Maladie de l’homme • Urgence • Etat du patient • Indications autres • Vasectomies • Professions • Sportifs • Information Patients et médecins

  17. Perspectives • Optimisation des méthodes de congélation • Tissu gonadiques • Meilleure information sur l’autoconservation • …. Lyophilisation du spermatozoïde !!! • Wakayama T. Yanagimachi R., • Nature Biotechnology 1998

  18. Préserver la fertilité chez le garçon prépubère

  19. Introduction • Enfant : préservation de la fertilité • A partir de 13-14 ans : spermatozoïdes • Avant 13-14 ans • Pas de spermatozoïdes éjaculés • Cellules souches germinales mâles : spermatogonies • Testicule • Spermatogonies • Pool de réserve : régénération  spermatozoïdes : à partir de la puberté • Préserver la fertilité : spermatogonies

  20. Stratégie de Préservation de la Fertilité des garçons prépubères • Avant le début du traitement stérilisant • Prélèvement de spermatogonies • Conservation spermatogonies : congélation • Après guérison • Greffe • Culture • Xénogreffe ? Recherche

  21. Préserver la fertilité des garçons : Espoirs Geens et al., 2008

  22. Questions • Quel volume de tissu à prélever ? • Un testicule entier • Fragments de testicule • Quel tissu conserver ? • Fragments de tissu • Suspension cellulaire • Quel protocole de congélation ?

  23. Questions • Contamination cellules malignes • Tri cellules malignes/testiculaires •  0,4% cellules malignes • Seuil inconnu chez l’homme • Contenu en spermatogonies • Faible : 3/10 000 cellules germinales (souris) • Enrichissement ? • Effets des traitements sur le testicule

  24. Utilisation • Tissu FRAIS : • Allogreffe • Injection spermatogonies dans tubules séminifères, rete testis, canaux efférents, … • Production de spermatozoïdes • Chez différentes espèces dont primates • Résultats chez la souris • Production de spermatozoïdes • Naissances • Xénogreffe • Tissu humain prépubère frais  souris nude (s/c) 4 et 9 mois après greffe : « qq spermatogonies survivantes » (Goossens et al., 2008)

  25. Utilisation • Tissu CONGELE • Survie cellulaire (souris, lapin, humain, …) • Xénogreffe sous cutané • production de spz (souris) • Survie spermatogonies (humain) • Culture • Souris • Multiplication des spermatogonies • obtention de spermatozoïdes • Peu de résultats dans d’autres espèces

  26. Autoconservations Spermatogonies • Radford et al., 1999 : 11 hommes • Bahadur et al., 2000 : 2 garçons (8 et 13 ans) • Keros et al., 2005 : 16 hommes • Kvist et al., 2006 : 8 garçons (1 à 5 ans 1/2) • Keros et al., 2007 : 5 garçons (2 à 14 ans) • France : 3 centres (+ 20 patients)

  27. En pratique • Préservation de la fertilité chez jeune garçon • Conservation de cellules souches spermatogonies • Utilisation • A déterminer • Dans 20 ans

  28. En pratique • Indications • Multidisciplinarité • Consentements (parents) • Technique expérimentale

  29. Préserver la fertilité chez la femme

  30. Mise en péril du stock folliculaire • Stock de follicules : • Pas de renouvellement • 6.106 (intra-utérin)  1.106 (naissance)  0,5.106 (puberté)  …… 99% des follicules : atrésie • Temps • Chimiothérapie (Alkylants+++) / Radiothérapie • Greffe médullaire : chimio+radio  ménopause 92% des cas (Meirow et al., 2001) • Pathologies malignes : • Femmes : K sein, K invasifs du col, leucémies, … • Enfance : leucémie, neurob., LH, ostéosarc., sarc.d'Ewing, LNH • Ovariectomie totale ou partielle : Endométriose, kystes bénins récurrents, tumeur • Ménopause précoce prévisible : X (Turner, délétion, inversion), génétiques, …

  31. Préserver la fertilité féminine aujourd'hui • Sans gamètes de la patiente : • Don ovocytes • Accueil d'embryons • Adoption • Avec gamètes de la patiente : • Transposition ovarienne • Traitement aux analogues du GnRH • Congélation d'ovocytes : matures ou immatures • FIV  embryons, congelés  transférés après guérison • Cryoconservation du tissu ovarien  Combiner plusieurs solutions

  32. CONGELATION D’OVOCYTES

  33. Congélation d’ovocytes • Stimulation de l’ovulation : temps, traitement hormonal • Pas de conjoint • pas de désir d’enfants immédiat • Ovocyte : cellule particulière, différente de l’embryon • volumineux cytoplasme • membrane plasmique • protocole de congélation particulier • Congélation lente • Vitrification • Effets de la congélation/décongélation: • Dégranulation prématurée des granules corticaux  durcissement de la Z.P. • Dépolymérisation du réseau de tubuline du fuseau méiotique et repolymérisation  aneuploidies, polyploidies ? Incubation de quelques heures pour permettre repolymérisation

  34. Congélation d’ovocytes • Résultats • Congélation lente • 1ère grossesse : Chen et al., 1986 • 532 enfants nés (1986-2008) • Implantation/100ovocytes décongelés : 2,2 • Naisances/100ovocytes décongelés : 2,3-2,2 (Oktay et al., 2006;2008) • Vitrification • 392 enfants nés (1986-2008) • Implantation/100ovocytes décongelés : 6,2 • Naisances/100ovocytes décongelés : 4,5-5,8 (Oktay et al., 2006;2008) • Vitrification • Technique prometteuse • en évaluation

  35. LA FECONDATION IN VITRO

  36. La F.I.V. • Stimulation de l’ovulation • Temps • Traitement hormonal • Conjoint • Désir d’enfants précipité ?

  37. LA CRYOCONSERVATION DE TISSU OVARIEN

  38. La cryoconservation du tissu ovarien • Pas de stimulation de l’ovulation • Pas de conjoint • Désir d’enfants différé • Femme < 35 ans • Enfant • Prélèvement per coelioscopique : Selon le risque estimé de castration : 1 ovaire entier ou ½ ovaire • Transport au laboratoire dans l’heure

  39. La cryoconservation du tissu ovarien • Garde cortex ovarien uniquement: • réserve folliculaire • 1-2 mm épaisseur • Médullaire ôtée • Découpe en bandelettes (5 x 10 mm) • Conservation : • Milieu cryoprotecteur (PROH, sucrose, …) • Cryotubes • Descente en température contrôlée  -196°C

  40. Utilisation du tissu ovarien congelé • Seuls les follicules primordiaux et primaires résistent à la congélation • Maturation : • GREFFE • Autogreffe : • Orthotopique, pelvienne : restauration de la fertilité naturelle • Hétérotopique : sous cutané, intra-musculaire , … : FIV • Xénogreffe : • Souris immunodéprimées (nude, SCID, …) • CULTURE IN VITRO • COMBINAISON greffe/culture in vitro ?

  41. Greffe de tissu ovarien congelé/décongelé • Autogreffe : • Avantages • "Simple" de réalisation • Revascularisation ‘spontanée’ • Succès chez animal et l’humain • Inconvénients : • Risque de transmission de cellules cancéreuses • Destruction folliculaire • Congélation/décongélation (survie 10 à 70%) • Ischémie post greffe (+++)

  42. 5 naissances rapportées à ce jour Donnez et al., 2004 Meirow et al., 2005 Demeestere et al., 2007 Andersen et al., 2008 Silber et al., 2008 September 24, 2004 Résultats

  43. Culture in vitro • Avantages : • Zone pellucide : exclue toute cellule, métastatique • Techniques : plusieurs étapes • Fragments de cortex ovarien : initiation de croissance ( follicule préantral) • Isole le follicule du cortex ( follicule antral) • Isole l'ovocyte ‘immature’ (follicule > 2 mm) maturation finale

  44. Culture in vitro • Résultats : • Follicule primordial  ovocyte mature : Une espèce : Souris • Eppig and O'Brien, 1996 : 1 souris vivante décès prématuré troubles neurologiques et hépatiques, obésité • O’Brien et al., 2003 : 48 souriceaux vivants en bonne santé • Femme : • Follicule primordial  secondaire (2 semaines !) • Follicule secondaire  antral • Follicule antral  ovocyte mature fécondable Maturation in vitro : 1ère naissance : Veeck et al., 1983 • Association xénogreffe puis culture in vitro ?

  45. Histological sections of in vitro grown human follicles cultured first in cortical strips for 6 days (Step 1) then subsequently isolated at the pre-antral stage and cultured for a further 4 days (step 2) in the presence (A and B) or absence (C and D) of 100 ng/ml of activin A. TISSU FRAIS Telfer, E. E. et al. Hum. Reprod. 2008 23:1151-1158; doi:10.1093/humrep/den070 Copyright restrictions may apply.

  46. Préserver la fertilité féminine ? BALANCE: • Altération de la fertilité par le traitement • Altération de la fertilité par le prélèvement d’ovaire (ovariectomie unilatérale ne divise pas le stock par deux) • Conjoint ? Désir d’enfants ? • Associer les différentes techniques • Congélation cortex ovarien • Congélation ovocytes immatures (follicules antraux) • Enfant : information aux parents

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