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Prolonger votre offre de soins, jour après jour

Séparation magnétique des plasmocytes dans le cadre des myélomes multiples. Elodie DAVID Equipe Onco-hématologie en cytogénétique. Prolonger votre offre de soins, jour après jour. Sommaire. Le Myélome Multiple : Définition . 2. La purification des plasmocytes : Pourquoi ?.

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Presentation Transcript

  1. Séparation magnétique des plasmocytes dans le cadre des myélomes multiples Elodie DAVID Equipe Onco-hématologie en cytogénétique Prolonger votre offre de soins, jour après jour

  2. Sommaire • Le Myélome Multiple : Définition 2. La purification des plasmocytes : Pourquoi ? 3. La séparation magnétique : Principe 4. Les outils de séparation : Différents appareils

  3. 1. Le Myélome Multiple • Définition : prolifération maligne d’un cloneplasmocytaireproduisant de manière inadaptée et exagérée une immunoglobuline ou l’un de ses fragments 3 stades (classification de Durie et Salmon) : Stade I Stade III Stade II Plasmoblastes Formation d’agrégats Plasmocytes matures Plasmocytes immatures Cytoplasme important

  4. 1. Le Myélome Multiple • Incidence: • Augmente avec l’âge • Légèrement plus fréquent chez l’homme que chez la femme • Moyenne d’âge de 64 ans • Signes cliniques: • Lésions osseuses • Hypercalcémie • Anémie • Insuffisance rénale… • Diagnostic : • Mise en évidence d’une gammapathie monoclonale sérique et/ou urinaire • Mise en évidence d’une prolifération plasmocytaire médullaire

  5. 1. Le Myélome Multiple • Anomalies cytogénétiques : • Hyperdiploïdie : 48-74 chromosomes : +3, +9, +15, +19… • Hypodiploïdie • t(4;14) • Délétion totale ou partielle des chromosomes 13 et 17 sans anomalies de structure associées    • Diagnostic et suivi : Cytogénétique conventionnelle : vue d’ensemble du caryotype  hyperdiploïdie Valeur pronostique permettant un traitement adapté ET Cytogénétique moléculaire : plus précis et sensible  anomalies fines comme t(4;14), del(13), del(17)

  6. 2. Pourquoi une purification des plasmocytes? Etude du Myélome Multiple = étude des plasmocytes Plasmocytes dilués dans la masse cellulaire Tri magnétique des plasmocytes avec étude des chromosomes 4, 14, 13 et 17

  7. 3. Séparation magnétique des plasmocytes Plasmocytes = CD138+ Principe : 1. Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique 2. Tri sur colonne magnétique 3. Création d’un champ magnétique 4. Récupération des plasmocytes en cassant le champ magnétique 3 appareils (Miltenyi) : - VarioMACS - AutoMACS - AutoMACS Pro

  8. 3. Séparation magnétique des plasmocytes Passage de l’échantillon dans une colonne de billes magnétiques Création d’un champ magnétique Récupération de la fraction négative 6 Filtration de la moelle totale • VarioMACS et AutoMACS 1 2 Réalisation d’un ficoll Récupération des globules blancs au niveau de l’anneau Cassure du champ magnétique Récupération fraction positive Plasma Cellules mononuclées Ficoll Polynucléaires et globules rouges 7 Lavage 3 Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique 4 Lavage 5

  9. 3. Séparation magnétique des plasmocytes • VarioMACS et AutoMACS  Perte cellulaire dans le ficoll : - cellules de tailles différentes III II I Utilisation de l’AutoMACS Pro - agrégations protéique et plasmocytaire Colonnes et valves souvent saturées Technique lourde (temps)

  10. 3. Séparation magnétique des plasmocytes 5 Tri magnétique sur AutoMacs Pro 3 tubes : échantillon, fraction négative et positive • AutoMACS Pro Filtration de la moelle totale 1 Sélection du programme 6 Lavage 2 Après cassure du champ magnétique, récupération fraction positive 7 3 Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique Après technique, 3 lames étalées : t(4;14),13 et 17 8 4 Lavage

  11. 3. Séparation magnétique des plasmocytes • AutoMACS Pro rendement augmenté (>86% : panel FISH complet) Travail sur moelle totale : Ac anti-CD138 plus concentrés Adaptation du programme de séparation pureté augmentée (<5% d’échec de purification) automate moins saturé, maintenance adaptée Gain de temps Tampons plus agressifs et filtres 40 µm Automatisation

  12. CONCLUSION Séparation magnétique : • routine dans les bilans de myélome multiple • si nécessaire préférée à la mise en culture • support pour les études pangénomiques

  13. Remerciements L’équipe d’onco-hématologie en cytogénétique, CERBA L’équipe de FISH, CERBA Hossain MOSSAFA, cytogénéticien à CERBA MILTENYI

  14. Annexe 1 : Classification de Durie et Salmon http://med2.pagesperso-orange.fr/import/CANCERO/CLASSIFICATION/MYELOME.htm

  15. Annexe 2 : quelques anomalies cytogénétiques del(17)(p11) Bandes R del(13)(q14q21) Bandes G 4p13 : fluorochrome rouge 14q32 : fluorochrome vert t(4;14)(p13;q32)

  16. Annexe 3 : mise en place d’un nouveau protocole 1er test 2007 : Programme Possel-D avec utilisation uniforme de 50µL d’Ac anti-CD138 Mauvais rendement : adaptation de la quantité d’Ac : 50µL Ac pour 107 cellules

  17. Annexe 4 : Comparaison des programmes de séparation Possel-D+Rinse # Possel WB+Clean PosselWB+Clean = Meilleur rendement Pas assez de noyaux pour réaliser une FISH

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