La réponse de la modélisation moléculaire

1. La réponse de la modélisation moléculaire Pourquoi les lipases sont-elles régiosélectives dans l'acylation de flavonoïdes ? Eduardo DE OLIVEIRA Catherine HUMEAU Elaine-Rose MAIA Latifa CHEBIL Mohamed GHOUL Jean-Marc ENGASSER Séminaire Annuel RP2E -- Le 15 janvier 2009

2. INTRODUCTIONET OBJECTIFS

3. Les flavonoïdes • Composés polyphénoliques à faible poids moléculaire (…) • Métabolites secondaires de nombreuses espèces végétales (…) Vaste spectre de propriétés biologiques bénéfiques, mais… … faible solubilité en milieu hydrophile et hydrophobe. (Harvsteen, 2002 ; Boudet, 2006 ; Chebil et al., 2007)

4. R-O O-R OH OH OH O-R HO OH OH R-O O-R HO HO OH O-R OH OH O-R HO O-R OH O-R HO OH Acylation de flavonoïdes • Permet d’augmenter leur hydrophobicité (lipophilisation) • Peut être accomplie par voie chimique ou enzymatique (Chebil et al., 2006, Villeneuve et al., 2007) • VOIE CHIMIQUE : Donneur d’acyle (R) P, T, milieu basique • VOIE ENZYMATIQUE : Donneur d’acyle (R) Enzyme

5. Structure de la CALB Cavité du site actif : « Triade catalytique » au fond Lipases • ENZYME = protéine qui catalyse des réactions chimiques • LIPASES = enzymes capables de catalyser les réactions : • Hydrolyse de liaisons ester en milieu aqueux • Formation de liaisons ester en milieu organique • De nombreuses applications en biotechnologie (Jaeger, 2002) • Lipase la plus utilisée : Candida antarctica lipase B (CALB)

6. O O O O H H H H O O O O O H H H H O O O H H H H O O O O O O OH OH O O H H O O O O O H H -CO-CH3 H H H O O O O O O O O H H H H O O O Deux cas d’acylation de flavonoïdes en utilisant la CALB ISOQUERCITRINE : Vinyl-acetate CALB 6’’OH (Nakajima et al., 1999 ; Stevenson et al., 2006 ; Chebil et al., 2007) QUERCÉTINE : Vinyl-acetate CALB Aucune réaction (Ardhaoui et al., 2004 ; Chebil et al., 2007)

7. Objectifs Utiliser des outils de SIMULATION MOLECULAIRE pour expliquer, dans le cas de l'acétylation enzymatique de l’isoquercitrine et de la quercétine, catalysée par la lipase B de Candida antarctica (CALB) : • LA SPECIFICITÉ : Pourquoi la CALB est-elle capable de catalyser l’acétylation de l'isoquercitrine mais pas celle de la quercétine ? (B) LA RÉGIOSÉLECTIVITÉ : Pourquoi, dans le cas de l'isoquercitrine, seulement un groupement hydroxyle (6’’-OH) précis du substrat réagit ?

8. METHODOLOGIE

9. Outils de simulation • Structure cristallographique de l’enzyme CALB : • Obtenue sur la Protein Data Bank (PDB) • Code 1LBS • Logiciels • Discovery Studio (v.1.7) • Insight (v. 2005) • Champ de forces : • CHARMm • Algorithme de docking : • LigandFit

10. Principe du docking Exploration de l’espace conformationnel du ligand Chaque conformation : 4 orientations possibles Chacune de ces orientations est placée dans la cavité (« pose »)

11. 15.000 conformères (= 60.000 poses) GÉNERÉES… … et seules les 50 les plus favorables RETENUES Choix de poses favorables Complémentarité géométrique : BONNE ADEQUATION DE FORME AVEC LA CAVITE Complémentarité chimique: INTERACTIONS FAVORABLES AVEC LES RESIDUS PROCHES • Liaisons H • Électrostatiques • Aromatiques (- et -) • Van der Waals • (…)

12. SUBSTRAT DOCKÉ Vinyl-acétate (donneur d’acyle) Flavonoïde (accepteur d’acyle) F – OH CH=CH2 CH3 H3C H2C = CH F Acyl-enzyme OH Enzyme régénérée H3C Flavonoïde acylé CIBLE DE DOCKING Mécanisme réactionnel simplifié Enzyme libre (adapté de Uppenberg et al., 1994)

13. (1) (3) HO (2) OH HO OH L’étape critique Flavonoïde docké dans la cavité de l’acyl-enzyme • Liaisons H entre ACE et les résidus Thr40 et Gln106 • Transfert de proton (activation de l’accepteur l’acyle) • Attaque nucléophile sur l’acyle-enzyme (adapté de Hult et al., 1998, 2000, 2001)

14. 2 ou 3 liaisons H ≤ 4Å HO ≤ 4Å OH HO OH Analyse des poses retenues MODE DE LIAISON PRODUCTIF : • Mode de liaison du ligand qui aboutit à une réaction. • Le substrat docké doit obéir à trois conditions : Flavonoïde docké dans la cavité de l’acyl-enzyme (Botta et al., 2002 ; Vallikivi et al., 2005 ; Palocci et al., 2007)

15. RESULTATSETDISCUSSION

16. Mode de liaison 1 Mode de liaison 2 O O H H O O O O H H O O H H O O O O O O H H O O O O O O H H H H H H O O O O H H PARTIE SUCRE AU FOND DE LA CAVITÉ PARTIE PHÉNOLIQUE AU FOND DE LA CAVITÉ Isoquercitrine

17. + hydrophile + hydrophobe Mode de liaison 1 VUE 1 : VUE FRONTALE DE LA CAVITE DE L’ENZYME (SURFACE DE CONNOLLY) SUCRE AU FOND DE LA POCHE Val149 Ile189 Partie phénolique à l’entrée Partie sucre vers le fond

18. Gln106 Thr40 Val149 ACE Ser105 His224 Ile189 Asp187 Mode de liaison 1 VUE 2 : VUE LATERALE DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANT SUCRE AU FOND DE LA POCHE • 3’’-OH : • His224:N : 8.7 Å • ACE:C : 7.4 Å • 4’’-OH : • His224:N : 6.2 Å • ACE:C : 4.6 Å • 6’’-OH : • His224:N : 4.0 Å • ACE:C : 3.5 Å

19. Gln106 Val149 Thr40 ACE Ser105 His224 Ile189 Asp187 Mode de liaison 2 VUE LATERALE DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANT PARTIE PHÉNOLIQUE AU FOND DE LA POCHE • 5-OH : • His224:N : 8.3 Å • ACE:C : 5.6 Å • 7-OH : • His224:N : 7.1 Å • ACE:C : 5.2 Å

20. Mode de liaison 1 Mode de liaison 2 A B C C B A CYCLE A AU FOND DE LA CAVITÉ CYCLE B AU FOND DE LA CAVITÉ Quercétine

21. Thr40 Gln106 Ser105 ACE His224 Asp187 Mode de liaison 1 VUE LATERALE DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANT CYCLE A AU FOND DE LA POCHE • 5-OH : • His224:N : 6.3 Å • ACE:C : 4.3 Å

22. Mode de liaison 2 VUE 2 : VUE DU LIGAND DOCKE ET DES RESIDUS INTERAGISSANT CYCLE B AU FOND DE LA POCHE Gln157 Thr40 • 3’-OH : • His224:N : 6.2 Å • ACE:C : 5.7 Å • 4’-OH : • His224:N : 4.5 Å • ACE:C : 3.7 Å Gln106 ACE Ser105 His224 Asp187

23. CONCLUSIONS

24. O H O H OK  H O O O H O O -CO-CH3 H H O O H ACE ACE O His224 His224 O O … acétylation seulement du 6’’-OH de la partie sucre. Pas d’acétylation sur la partie phénolique et… ISOQUERCITRINE Acétylation seulement du 6’’-OH de la partie sucre.

25. O H O H OK  O H O OH O O H ACE His224 ACE His224 Pas d’acétylation sur le cycle B… … ni sur le cycle A. QUERCÉTINE Aucune réaction

26. MODÈLES EXPÉRIENCE Trois CRITÈRES STRUCTURAUX doivent être satisfaits pour qu’un complexe enzyme-substrat puisse être considéré comme RÉACTIF : • 2 ou 3 liaisons H entre l’acyle-enzyme et le « oxyanion hole » • Au moins un OH à ≤ 4 Å de l’atome Ace:C • Au moins un OH à ≤ 4 Å de l’atome His224:N (A) LA SPECIFICITÉ : Isoquercitrine : au moins un mode de liaison satisfait aux critères de réactivité = réaction OK  Quercétine : aucun mode de liaison ne satisfait aux critères de réactivité = absence de réaction NON  (B) LA RÉGIOSÉLECTIVITÉ : 6’’-OH : le seul OH de l’isoquercitrine satisfaisant aux critères de réactivité (donc le seul à pouvoir réagir). MÉTHODOLOGIE PRÉDICTIVE ? ? ?

27. Équipe Biocatalyse-Bioprocédes - LIBio – ENSAIA / INPL • Eduardo Basilio DE OLIVEIRA(doctorant - 3ème année) • Catherine HUMEAU (Maître de conférences) • Mohamed GHOUL (Professeur) • Jean-Marc ENGASSER (Professeur) • Latifa CHEBIL (Maître de conférences) • Évelyne RONAT (Informaticienne) Collaborateurs – experts en Modélisation Moléculaire • Elaine-Rose MAIA (Professeur – Université de Brasilia – Brésil) • Bernard MAIGRET (Directeur de recherche - LORIA –CNRS)  MERCI DE VOTRE ATTENTION !