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实验一 质粒 DNA 的小量制备

实验一 质粒 DNA 的小量制备. 一 实验原理. 什么是质粒？ 质粒是细胞内的一种环状的小分子 DNA ，是进行 DNA 重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒 DNA 上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在 DNA 重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。. 一 实验原理. 根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性 DNA 在拓扑学上的差异来分离。 在 pH12.0  12.5 这个狭窄的范围内，线性 DNA 双螺旋结构解开而被变性。

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实验一 质粒 DNA 的小量制备

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Presentation Transcript

  1. 实验一 质粒DNA的小量制备

  2. 一 实验原理 • 什么是质粒？ • 质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

  3. 一 实验原理 • 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。 • 在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。 • 当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。

  4. 一 实验原理 • 分离质粒DNA有三个步骤： • 培养细菌使质粒扩增， • 收集和裂解细菌， • 分离和纯化质粒DNA。

  5. 一 实验原理 在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒： 共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂； 超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂； 松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；

  6. 二实验试剂 • pGEX-6p质粒载体菌, • LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素）， • 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I）， • NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)， • RNase A， • 95%乙醇，70%乙醇， • TE buffer（pH8.0）。

  7. 三实验准备 • 1 氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20C保存）， • 2 配制LB培养基 （胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL dd water 搅拌完全溶解，用约200L 5N NaOH调pH至7.0，加dd water至1L，121C 20min灭菌）；

  8. 三实验准备 3溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）； • 溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895¡104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。 • 溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）； • 溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml），

  9. 三实验准备 • 4 70%乙醇（-20C保存）， • 5 TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）； • 6 摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121C 30min）。

  10. 四 操作步骤 • 1 在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。 • 2 取出保存pGEX-6p载体的菌种, 在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于5ml无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37C摇床中摇20h。 • 3取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，12000 rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。

  11. 四 操作步骤 • 4在沉淀中加入用冰预冷的100l 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。 • 5加入200l 溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管５次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，插入冰中，放置5min。 • 6 加入用冰预冷的150l 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

  12. 四 操作步骤 • 7 12000 rpm离心5min，小心吸取400l 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800l 95% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。 • 8 12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净, • 9 再加入500l 70% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。12000 rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净，可将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。

  13. 四 操作步骤 • 10 离心管倒置于37C培养箱中（或室温）空气干燥10分钟。。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。 • 11 每管加入10LTE缓冲液混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认，用记号笔标记后放入冰箱中备用。 • 12 在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告

  14. 五 思考题 • 影响本实验结果的因素有哪些？

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