1 / 26

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR Petr Koutecký & Jiří Košnar, 201 3. Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364. Historie. Co bylo před PCR? k dispozici pouze DNA, kterou se podařilo vyizolovat

summer
Download Presentation

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4 . PCR

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 4. PCR Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013 Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

  2. Historie • Co bylo před PCR? • k dispozici pouze DNA, kterou se podařilo vyizolovat • fragmenty DNA bylo možné namnožit klonováním (zač. 70. let) (zapojením do plazmidu a vnesením do bakt. buněk) • sekvenování NK (od konce 70. let) • RFLP

  3. RFLP • RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) • variabilita generována restrikčními enzymy z bakterií - rozpoznávají krátkou specifickou sekvenci dsDNA • vyizolovaná genomová DNA naštěpena jedním nebo více enzymy • fragmenty separovány ELFO, vizualizace obarvením, nebo přenesením na membránu a hybridizací se značenou DNA sondou (Southern-blot) • sondy: • specifické pro určitý lokus (např. rDNA; další využití – restrikční mapování genomu, určování pořadí genů pomocí genově specifických sond) • multilokusové (např. hypervariabilní repetitivní sekvence: mini- a mikrosatelity)

  4. RFLP RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Lokusově specifická sonda: variabilita RFLP patternů 11 izolátů Candida albicans (A - celková genomická DNA po naštěpení enzymem EcoRI) B - Southern blot hybridizace se sondou pro oblast 28S, 18S a 5S rDNA

  5. RFLP RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Multilokusová sonda: variabilita patternů generovaných pomocí 2 mikrosatelitových sond (r. Candida)

  6. PCR • PCR: • Polymerase Chain Reaction • in vitro namnožení určité části DNA • *1983, ale první (zapomenuté) pokusy už v r. 1971; Nobelova cena za chemii (1993)

  7. Princip PCR Templát. DNA Princip PCR PCR cycling 1) • vždy musíme mít k dispozici primery: levý-forward a pravý-reverse • elongace produktu 5´→3´! • první nasynt. vlákna jsou o něco delší než cílový produkt, cyklováním ale téměř absolutně převládne cílový produkt • teoreticky by měla stačit 1 molekula, v reálu je potřeba o něco víc (aspoň 10?) 2) Elongace 3) (DNA polymeráza)

  8. Princip PCR Princip PCR enzymatická syntéza DNA: prodlužování vlákna vždy ve směru 5´→3´ (nezapomenout na to ani při designu primerů!)

  9. Princip PCR Princip PCR • počet kopií narůstá exponenciálně, postupně ale pokles - opotřebování polymerázy, inhibice narůstajícím množstvím nově nasynt. DNA (nastává obvykle po 30-35 cyklech)

  10. Princip PCR • PCR cyklus: • denaturace – rozpletení dvouvlákna templátové DNA, obvykle stačí 94-95°C, 30-60 s • (záleží na CG obsahu, lze ovlivnit přidáním aditiv)

  11. Princip PCR • PCR cyklus: • annealing (nasedání) primerů • obvykle v rozmezí ca 48-62°C, 30-60 s • specifické pro každý primerový pár, nutné optimalizovat, příp. odhadnout podle sekvence primerů • přibližně o 3-5°C pod metling temperature (Tm) primerů: Tm =  64.9°C + 41°C x (počet G + C – 16.4) / délka primeru [bp]–pro primery>14bp (Tm = 4°C  x  ( počet G + C) + 2°C  x  (počet A + T) – pro primery <14bp, Wallace rule) http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx

  12. Princip PCR • PCR cyklus: • elongace – syntéza komplement. vlákna DNA polymerázou • teplota podle typu polymerázy, obvykle 72°C (ale ~10% aktivity v 37°C) • délka podle aktivity polymerázy a délky amplifikovaného úseku Taq: 1000 bp/min • Taq polymerázy před odpadnutím z vlákna DNA dávají na jeho konec jeden A (terminal transferase activity; využití při AT klonování)

  13. Princip PCR Složení PCR reakce: • primery: 0.1-1 µM každého primeru • reakční pufr (Tris-HCl): • MgCl2 příp. MgSO4: 1-4 mM (Mg2+ je kofaktor polymeráz) • KCl: 50 mM • deoxynukleotidy (dNTP): 40-200 µM každého typu dNTP • polymeráza: 0.5-2U / 25 µl reakce • templát: 1-1000 ng / 25 µl reakce (pro genomovou DNA) • s PCR chemikáliemi pracovat na ledu, skladovat v -20°C (hlavně polymeráza!) • ideálně alikvoty (dNTP jsou senzitivní na opakované zamražování; výhodné i proti kontaminacím) • PCR produkt naopak snese hodně…

  14. Princip PCR Příklad PCR cyklování: • 95°C – 3 min počáteční denaturace DNA 35x: 95°C – 3 min denaturace Ta – 1 min nasedání primerů 72°C – 1 min elongace 72°C – 10 min závěrečná elongace (dosynt. případná neúplná vlákna) 5°C hold temp. drží teplotu dokud nevyzvedneme vzorky z cykleru Vlastní příprava PCR: • objem 1 reakce může být libovolně v rozmezí 5-100 µl • namíchat mix pro požadovaný počet vzorků, vždy používat negativní kontrolu (PCR směs bez DNA → kontrola reakčních komponent, zda nejsou kontaminované DNA) • komerčně dodávané premixy – obsahují všechny složky reakce kromě primerů a templátu • před přesunem do cykleru držet vzorky na ledu

  15. Princip PCR ELFO produktu PCR: amplifikace 1 lokusu (za předpokladu, že se alely neliší délkou): neg. kontrola (bez templátu) cílový PCR produkt nespecifický PCR produkt dimery primerů

  16. Princip PCR • PCR polymerázy: • nejdříve se musely měnit po každém PCR cyklu (zničení tepelnou denaturací; Klenowův fragment) • průlomem izolace termostabilní Taq polymerázy *1965 (bakterie Thermus aquaticus) • různé typy PCR polymeráz se liší: • procesivitou - počet nasynt. bp/min • chybovostí - inkorporace nesprávného nukleotidu • reakčními podmínkami - složení reakčního pufru, elongační teplota, kolik musíme dát enzymu atd.

  17. Princip PCR • nejčastěji používané PCR polymerázy: • Taq(Thermus aquaticus; 1965) 1 kb/min (<5 kb), 72°C, frekvence chyb 1x10-4– 2x10-5, tvoří polyA-konce; nejlevnější • Pfu (Pyrococcus furiosus; 1991) 0.5-1 kb/min, 72°C, frekvence chyb ~2x10-6 (proof-reading = 3´to 5´ exonuclease activity, high fidelity), ale netvoří polyA-konce; MgSO4 jako zroj Mg2+ • modifikace Taq a její směsi s proof-readingovými enzymy (např. Ex Taq apod.): tvoří polyA-konce, chybovost ~mezi Taq a Pfu

  18. Princip PCR amplifikace dlouhých úseků, genomových fragmentů: • Phusion polymerase (<20 kb) rychlá - 1 kb/15-30s; 6x míň chyb než Pfu (proof-reading) ◄ fúze dvou proteinů: modrá jednotka váže dsDNA zelená jednotka (~Pyrococcus) syntetizuje • LA polymerase (<30-40 kb; Long and Accurate) 1kb/min; Taq polymeráza + proof-reading jednotka

  19. Optimalizace PCR • Odstranění nespecifických produktů: • příčina: nespecifická vazba primerů • teplota annealingu – zkusit různé Ta, nebo gradient (např. po 2-3°C) • touch-down PCR: první cykly PCR jsou zásadní pro specifitu → pokud primery nenasedají specificky, tak se případný mismatch zafixuje; začít s vyšší Ta, a postupně ji snižovat (např.: 1. cyklus – 60°C, 2. cyklus 59°C, ...) • zkrácení času annealingu • snížit koncentraci primerů, polymerázy • koncentrace MgCl2 (např. po 0.5 mM) - spíše snižovat • koncentrace KCl (ovlivňuje denaturaci DNA, kratší fragmenty preferenčně denaturují za vyšší koncentrace KCl) • krátké nespecif. produkty: ↓ KCl • dlouhé nespecif. produkty: ↑ KCl (> 50 mM může inhibovat Taq)

  20. Optimalizace PCR • Odstranění nespecifických produktů: • příčina: nespecifická vazba primerů • dlouhé nespecif. produkty může redukovat zkrácení elongace • Cold-start: vzorky před umístěním do cykleru držet na ledu! (omezení aktivity polymerázy) Hot-start polymerázy: blokovány navázanou protilátkou, aktivovány až počáteční denaturací → nevznikají nespecifické PCR produkty způsobené sníženou aktivitou polymerázy před umístěním vzorků do cykleru • ředění DNA templátu (1:10, 1:100...) • snižování počtu PCR cyklů

  21. Optimalizace PCR • Odstranění nespecifických produktů: • příčina: krátké, zdánlivé nespecif. produkty mohou být • nedosyntetizovaná vlákna cílového úseku • podpořit činnost polymerázy • prodloužením času elongace • zvýšením koncentrace polymerázy • koncentrace MgCl2 • aditiva vázající inhibitory polymerázy (BSA, T4 protein) • prodloužit čas denaturace, nebo přidat aditiva usnadňující denaturaci templátu (10% DMSO, 5% formamid)

  22. Optimalizace PCR • Odstranění nespecifických produktů: extrakce - vyřezávání cílových bandů z agarózy po ELFO (vhodné např. pro sekvenaci, klonování) • asi nejefektivnější postup pro odstranění dimerů primerů • celý vzorek nanést na 1-1.5% agarozový gel, nechat rozjet v ELFO • ideálně Sybr Green + modré světlo (UV fragmentuje DNA, proto minimalizovat dobu expozice / odstínit např. skleněnou petriskou) • vyřízlý kousek agarózy s cílovým bandem purifikovat běžně dostupnými kity (lyze agarózy, purifikace DNA na membráně) • může být ztrátové → dělat větší PCR reakce (např. 30 a víc µl)

  23. Optimalizace PCR 2. Slabá nebo žádná amplifikace • chyba při míchání PCR, nesprávný program apod. – odhalí se pomocí pozitivní kontroly(= vzorek templátu, u kterého máme ověřené, že amplifikuje) • teplota annealingu – pomůže především snižování • zvýšit počet cyklů PCR (max. ca 45) • pokud je málo cílové DNA, pozor na kontaminace! • zvýšit koncentraci templátu • nebo naopak templát ředit (1:10 – 1:1000) – pokud obsahuje inhibitory • spike control: pozitivní kontrola + vzorek, který nefunguje → pokud nedá produkt, je to inhibitory ve vzorku • zvýšit koncentraci primerů, polymerázy • gradient koncentrace MgCl2 • aditiva vázající inhibitory polymerázy (BSA, T4 protein), nebo usnadňující denaturaci templátu (DMSO, komerční PCR enhancery)

  24. Optimalizace PCR 2. Slabá nebo žádná amplifikace • použití více PCR: více cyklů PCR, méně opotřebované polymerázy a) reamplifikace • vzorek PCR reakce (např. 1 µl z 25 µl rce), která na gelu nedala band, se použije jako templát pro novou PCR za ± stejných reakčních podmínek • někdy nefunguje (dané typem použitých primerů???) b) nested PCR • vzorek PCR reakce se použije jako templát pro novou PCR za použití vnitřních primerů (příp. se použije jeden vnitřní primer + jeden z primerů původní PCR = semi-nested PCR) • obvykle funguje lépe • umožňuje větší specifitu (selektují až 4 primery!) • x musíme mít vnitřní primery...

  25. Optimalizace PCR 2. Slabá nebo žádná amplifikace • zkontrolovatprimery: zda sedí na naši cílovou sekvenci - kritický je mismatch na 3´ konci, kde nasedá polymeráza • pokud nesedí, pokusit se o design novýchprimerů: • shromáždit co nejvíc cílových sekvencí, vytipovat vhodná místa - co nejvíce konzervované mezi cílovými sekvencemi • někdy jsou sekvence tak variabilní, je nutné použít tzv. degenerované báze (IUPAC kód - např. M značí A nebo C) http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ - program na design primerů, umožňuje mj. zvolit oblast kam chceme v sekvenci umístit primery, testuje jejich parametry http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx - pokročilejší testování parametrů primerů

  26. Optimalizace PCR Obecná pravidla pro design primerů: • 15-28 bp dlouhé, GC obsah 40-60% • pro optimální specifitu by 3´ konec měl být bohatší na GC, ale ne víc jako 3 GC v posledních 5 bázích (zvyšuje riziko nespecif. nasedání) • oba primery by se neměly příliš lišit v teplotě nasedání (max. ~3°C) • neměly by tvořit smyčky, které nedenaturují za annealingové teploty • pozor na dimery primerů: • ◄ stabilní dimer primerů (Delta G<6 kcal/mol), • který je při PCR elongován (5´- 3´!) • pro důslednou eliminaci dimerů nastavit např. v Primer3: • Max Self Complementarity: 3 • Max Self Complementarity: 1 někdy i ideální primery nefungují a naopak teoreticky špatné fungují bez problémů...

More Related