Enzimas de restricci n
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Enzimas de Restricción. Biol 3306 – Lab de Genética JA Cardé , phd UPR – Aguadilla. Objetivos. Al completar esta presentación los estudiantes podrán : Definir lo que son las enzimas de restricción Describir los criterios para su nomenclatura

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Enzimas de Restricción

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Presentation Transcript


Enzimas de restricci n

Enzimas de Restricción

Biol 3306 – Lab de Genética

JA Cardé, phd

UPR – Aguadilla


Objetivos

Objetivos

  • Al completarestapresentación los estudiantespodrán:

  • Definir lo que son lasenzimas de restricción

  • Describir los criteriosparasunomenclatura

  • Explicar los factoresqueafectan la actividad de estas.

  • Mencionaralgunasaplicaciones de importancia de estas.

  • Prepararunareacción de digestión de DNA con enzimas de restricción


Introducci n vectores

Introducción:Vectores

  • 70’s: se crean exitosamente las primeras moléculas recombinantes

  • Se ligan fragmentos de DNA de orígenes distintos

  • Se logra introducir moléculas recombinantes dentro de células

  • Una vez en célula huésped,

    • se replica

    • produce varias copias idénticas del gene

    • se expresa

    • esto se le llama clonación.


Introducci n vectores1

Introducción: vectores

  • Para clonar un gen la fuente para el gen es el DNA cromosómico del organismo que lo tiene.

  • Para hacerlo llegar al interior de la nueva célula hay que usar un vehículo o vector

  • Los vectores comúnmente usados en experimentos de clonación derivan de plásmidos o de virus

  • La mayoría son plásmidos, pequeños, circulares, naturales en algunas células, confieren fenotipos observables

    • Ori

    • Secuencias marcador

    • MCS


Vector

Vector


Enzimas

Enzimas

  • Proteínas

  • Aceleranreaccionesquímicas

  • Reducen la E de activación

  • E + S  ES  E + P

  • Ejemplos

    • Proteasas

    • Lipasas

    • amilasas

    • Dehidrogenasas

    • Girasas

    • Ligasas

    • Peptidasas

    • NUCLEASAS


Enzimas de restricci n1

Enzimas de restricción

  • Descubiertas 1970, Daniel Nathans

  • Cortan el enlace azucar-fosfato del DNA, en ambas cadenas

  • Aisladas de bacterias, cientos

  • Función: mecanismo de defensa de la bacteria contra DNA extraño (fagos)

  • Sistema de restricción/modificación

    • Restricción/Metilación

    • Nombre, quien la produce

    • EcoRI – Escherichiacoli (cepa RY13)

    • Hind II – Haemophilusinfluenzae

    • XhoI – Xanthomonasholcicola


Enzimas de restricci n palindrome

Enzimas de restricción: Palindrome?

  • Reconocenpalíndrome, específicas

  • Secuenciaque lee lo mismo en ambascadenas, en orientaciónopuesta

    • 5’3’

    • 3’5’

    • 4, 6, 8 bp

    • 1/256bp, 1/4096bp

    • Isoesquisomeros

    • ambiguos-(Py-Pu)

    • DNA learning center


Enzimas de restricci n2

Enzimas de restricción:

  • Cortan el enlace fosfodiester

  • Blunts ends

    • Enzimacortasimétricamente, en sitiosopuestos en ambascadenas

  • Sticky or cohesive ends

    • - enzimacortaasimétricamente, un pedacito SS se extiendedesde el 5’ o desde el 3’

  • 5’ overhangs

  • 3’ overhangs


Enzimas de restricci n3

Enzimas de restricción:

  • Cuidados:

  • Caras, se vendenporunidades

    • Unidad: cantidad de enzimanecesariaparadigerir 1µg de DNA segúnlascondiciones del fabricante

  • Sensitivas al calor

    • -20oC o hielosiempre

  • Contaminacióncruzada

    • Pipeteo: puntanuevasiempre!!!


Enzimas de restricci n4

Enzimas de restricción:

  • Reacción, mezclar y sedimentarbien.

    • DNA: limpio de contaminantes: fenol, cloroformo, etanol o sales

      • 1µg/µl de volumen (no mas)

    • Amortiguador: iones, sales, pH, distintosparacadaenzima

      • 10X  1X: dilución 1:10 con el volumen

    • Enzima: de acuerdo al palíndromeo paraaveriguarsiestapresente

      • 1U/µg de DNA

    • Agua paracompletarvolumen

    • Incubadora a 37oC por 30-60 minutos


Enzimas de restricci n5

Enzimas de restricción:

  • Factoresqueafectan la reacción:

    • Composición del amortiguador

      • Fuerzaiónica: [sales] y Na o K, pH (8)

    • Temperatura de incubación

      • 37C, termofílicas a 50-65oC

      • Termolábiles, 25oC

    • Metilación

      • Cepa de E coli, asegurarse de suactividad de metilasas


Enzimas de restricci n6

Enzimas de restricción:

  • Aplicaciones

    • Clonar- introducir un pedazo de DNA en un vector

      • Cortar vector y cortarinserto

    • Mapas de restricción

      • Determinarlugares de restriccionparaenzimas en algun vector o en unasecuencia a clonar

    • Southern Blot

      • Detectar la presencia de un gen o unasecuencia dada en unamezcla de fragmentos de DNA cromosomal


Enzimas de restricci n7

Enzimas de restricción:

  • Aplicaciones

    • Clonar- introducir un pedazo de DNA en un vector

  • - cortar el vector

  • - cortar DNA fuente del inserto de interés

  • - mezclar y ligar

  • - transformar

  • - cultivar en medio de selección por el antibiótico


Enzimas de restricci n8

Enzimas de restricción:

  • Aplicaciones

    • Mapas de restricción

  • - aislar el vector

  • - incubar muestras de este con la enzima de interés o con combinaciones de estas

  • - analizar la reacción por electroforesis (fragmentos se separan por tamaños)

  • - comparar estos con un marcador y determinar sus tamaños

  • - deducir (lógica) el mapa del vector

  • Tutorial


Enzimas de restricci n9

Enzimas de restricción:

  • Aplicaciones

    • Southern Blot

  • Aislar genoma

  • Cortar con enzimas

  • Electroforesis

  • Transferencia

  • Incubar con sonda radioactiva

  • Autoradiografía

  • Cuantas copias hay en un genoma?

  • Hay deleciones?

  • Se parecen estos genes

  • Zoo blot (parecido entre especies)


Enzimas de restricci n10

Enzimas de restricción:

  • Aplicaciones

    • Southern Blot

  • Edward Southern -1975cuantas copias de un gen hay en un genoma?

  • detección de deleciones pequeñas (diagnostico clínico)

  • identificación de familias de genes (varios genes derivados de uno común.

  • identificar genes homólogos en distintas especies

  • el gen de interés estará clonado para usarlo como sonda marcada para buscar en la mezcla de fragmentos por complementariedad


Enzimas de restricci n11

Enzimas de restricción:

  • Materiales

  • Microtubos

  • Micropipetas y puntas

  • Incubadora

  • Agua ultrapura

  • DNA a cortar (x ugs)

  • Buffer de la enzima de restricción

  • Enzima de restricción

  • Hielo


Enzimas de restricci n12

Enzimas de restricción:

  • Protocolo

  • 1. Analizar la reacción a realizar

  • 2. Calcular los volúmenes a servir en la reacción de cada uno de los reactivos

  • 3. Rotular 2 microtubos de 500µl o 1.5 ml, Control y: 1G, 1P, 2G, 2P, etc, según aplique.

  • 4. Descongelar los reactivos a utilizar en la reacción

  • 5. Cuidar que la enzima siempre este en hielo

  • 6. Añadir en cada tubo, observando cuidadosamente que se mezclan, las cantidades correspondientes en el siguiente orden:

    • Agua

    • Buffer

    • DNA

    • Enzima


Enzimas de restricci n13

Enzimas de restricción:

  • Protocolo

  • 7. Mezclar con finger-vortex

  • 8. Centrifugar en la micro-centrifuga 30 seg

  • 9. Incubar por 1 hora a 37oC

  • 10. Guardar a -20oC

  • 11. Analizar por electroforesis de agarosa.

    • Ejemplo de Reacción


Preguntas

Preguntas

  • Como es mas específicoparaclonar un fragmento de DNA en un vector, con una o con dos enzimas? Porque? Mencioneventajas o desventajas de cada forma.

  • Si unaenzimaviene a 22000 U/ml, cuantos µl necesitoparadigerir 4 µg de DNA?

  • Porquelasbacterias no digierensupropio DNA con susenzimas de restricción?

  • Derive una formula paracalcularcuantosfragmentos de DNA salen de unamolécula de DNA cortada con unaenzima de restricción, si la moléculaes lineal vssies circular?


Referencias

Referencias

  • Brooker, Robert J. (2014). GeneticsAnalysis & Principles. (Quinta Edición). New York, McGraw-Hill Companies, Inc.

  • Alberts, et. Al, (2013). Essential Cell Biology, Garland Sciences Publishing, New York.

  • http://www.dnalc.org/resources/animations/restriction.html

  • http://www.restrictionmapper.org/

  • http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/renzymes.html


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