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Enzimas de Restricción

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Enzimas de Restricción. Biol 3306 – Lab de Genética JA Cardé , phd UPR – Aguadilla. Objetivos. Al completar esta presentación los estudiantes podrán : Definir lo que son las enzimas de restricción Describir los criterios para su nomenclatura

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enzimas de restricci n

Enzimas de Restricción

Biol 3306 – Lab de Genética

JA Cardé, phd

UPR – Aguadilla

objetivos
Objetivos
  • Al completarestapresentación los estudiantespodrán:
  • Definir lo que son lasenzimas de restricción
  • Describir los criteriosparasunomenclatura
  • Explicar los factoresqueafectan la actividad de estas.
  • Mencionaralgunasaplicaciones de importancia de estas.
  • Prepararunareacción de digestión de DNA con enzimas de restricción
introducci n vectores
Introducción:Vectores
  • 70’s: se crean exitosamente las primeras moléculas recombinantes
  • Se ligan fragmentos de DNA de orígenes distintos
  • Se logra introducir moléculas recombinantes dentro de células
  • Una vez en célula huésped,
    • se replica
    • produce varias copias idénticas del gene
    • se expresa
    • esto se le llama clonación.
introducci n vectores1
Introducción: vectores
  • Para clonar un gen la fuente para el gen es el DNA cromosómico del organismo que lo tiene.
  • Para hacerlo llegar al interior de la nueva célula hay que usar un vehículo o vector
  • Los vectores comúnmente usados en experimentos de clonación derivan de plásmidos o de virus
  • La mayoría son plásmidos, pequeños, circulares, naturales en algunas células, confieren fenotipos observables
    • Ori
    • Secuencias marcador
    • MCS
enzimas
Enzimas
  • Proteínas
  • Aceleranreaccionesquímicas
  • Reducen la E de activación
  • E + S  ES  E + P
  • Ejemplos
    • Proteasas
    • Lipasas
    • amilasas
    • Dehidrogenasas
    • Girasas
    • Ligasas
    • Peptidasas
    • NUCLEASAS
enzimas de restricci n1
Enzimas de restricción
  • Descubiertas 1970, Daniel Nathans
  • Cortan el enlace azucar-fosfato del DNA, en ambas cadenas
  • Aisladas de bacterias, cientos
  • Función: mecanismo de defensa de la bacteria contra DNA extraño (fagos)
  • Sistema de restricción/modificación
    • Restricción/Metilación
    • Nombre, quien la produce
    • EcoRI – Escherichiacoli (cepa RY13)
    • Hind II – Haemophilusinfluenzae
    • XhoI – Xanthomonasholcicola
enzimas de restricci n palindrome
Enzimas de restricción: Palindrome?
  • Reconocenpalíndrome, específicas
  • Secuenciaque lee lo mismo en ambascadenas, en orientaciónopuesta
    • 5’3’
    • 3’5’
    • 4, 6, 8 bp
    • 1/256bp, 1/4096bp
    • Isoesquisomeros
    • ambiguos-(Py-Pu)
    • DNA learning center
enzimas de restricci n2
Enzimas de restricción:
  • Cortan el enlace fosfodiester
  • Blunts ends
    • Enzimacortasimétricamente, en sitiosopuestos en ambascadenas
  • Sticky or cohesive ends
    • - enzimacortaasimétricamente, un pedacito SS se extiendedesde el 5’ o desde el 3’
  • 5’ overhangs
  • 3’ overhangs
enzimas de restricci n3
Enzimas de restricción:
  • Cuidados:
  • Caras, se vendenporunidades
    • Unidad: cantidad de enzimanecesariaparadigerir 1µg de DNA segúnlascondiciones del fabricante
  • Sensitivas al calor
    • -20oC o hielosiempre
  • Contaminacióncruzada
    • Pipeteo: puntanuevasiempre!!!
enzimas de restricci n4
Enzimas de restricción:
  • Reacción, mezclar y sedimentarbien.
    • DNA: limpio de contaminantes: fenol, cloroformo, etanol o sales
      • 1µg/µl de volumen (no mas)
    • Amortiguador: iones, sales, pH, distintosparacadaenzima
      • 10X  1X: dilución 1:10 con el volumen
    • Enzima: de acuerdo al palíndromeo paraaveriguarsiestapresente
      • 1U/µg de DNA
    • Agua paracompletarvolumen
    • Incubadora a 37oC por 30-60 minutos
enzimas de restricci n5
Enzimas de restricción:
  • Factoresqueafectan la reacción:
    • Composición del amortiguador
      • Fuerzaiónica: [sales] y Na o K, pH (8)
    • Temperatura de incubación
      • 37C, termofílicas a 50-65oC
      • Termolábiles, 25oC
    • Metilación
      • Cepa de E coli, asegurarse de suactividad de metilasas
enzimas de restricci n6
Enzimas de restricción:
  • Aplicaciones
    • Clonar- introducir un pedazo de DNA en un vector
      • Cortar vector y cortarinserto
    • Mapas de restricción
      • Determinarlugares de restriccionparaenzimas en algun vector o en unasecuencia a clonar
    • Southern Blot
      • Detectar la presencia de un gen o unasecuencia dada en unamezcla de fragmentos de DNA cromosomal
enzimas de restricci n7
Enzimas de restricción:
  • Aplicaciones
    • Clonar- introducir un pedazo de DNA en un vector
  • - cortar el vector
  • - cortar DNA fuente del inserto de interés
  • - mezclar y ligar
  • - transformar
  • - cultivar en medio de selección por el antibiótico
enzimas de restricci n8
Enzimas de restricción:
  • Aplicaciones
    • Mapas de restricción
  • - aislar el vector
  • - incubar muestras de este con la enzima de interés o con combinaciones de estas
  • - analizar la reacción por electroforesis (fragmentos se separan por tamaños)
  • - comparar estos con un marcador y determinar sus tamaños
  • - deducir (lógica) el mapa del vector
  • Tutorial
enzimas de restricci n9
Enzimas de restricción:
  • Aplicaciones
    • Southern Blot
  • Aislar genoma
  • Cortar con enzimas
  • Electroforesis
  • Transferencia
  • Incubar con sonda radioactiva
  • Autoradiografía
  • Cuantas copias hay en un genoma?
  • Hay deleciones?
  • Se parecen estos genes
  • Zoo blot (parecido entre especies)
enzimas de restricci n10
Enzimas de restricción:
  • Aplicaciones
    • Southern Blot
  • Edward Southern -1975cuantas copias de un gen hay en un genoma?
  • detección de deleciones pequeñas (diagnostico clínico)
  • identificación de familias de genes (varios genes derivados de uno común.
  • identificar genes homólogos en distintas especies
  • el gen de interés estará clonado para usarlo como sonda marcada para buscar en la mezcla de fragmentos por complementariedad
enzimas de restricci n11
Enzimas de restricción:
  • Materiales
  • Microtubos
  • Micropipetas y puntas
  • Incubadora
  • Agua ultrapura
  • DNA a cortar (x ugs)
  • Buffer de la enzima de restricción
  • Enzima de restricción
  • Hielo
enzimas de restricci n12
Enzimas de restricción:
  • Protocolo
  • 1. Analizar la reacción a realizar
  • 2. Calcular los volúmenes a servir en la reacción de cada uno de los reactivos
  • 3. Rotular 2 microtubos de 500µl o 1.5 ml, Control y: 1G, 1P, 2G, 2P, etc, según aplique.
  • 4. Descongelar los reactivos a utilizar en la reacción
  • 5. Cuidar que la enzima siempre este en hielo
  • 6. Añadir en cada tubo, observando cuidadosamente que se mezclan, las cantidades correspondientes en el siguiente orden:
    • Agua
    • Buffer
    • DNA
    • Enzima
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Enzimas de restricción:
  • Protocolo
  • 7. Mezclar con finger-vortex
  • 8. Centrifugar en la micro-centrifuga 30 seg
  • 9. Incubar por 1 hora a 37oC
  • 10. Guardar a -20oC
  • 11. Analizar por electroforesis de agarosa.
    • Ejemplo de Reacción
preguntas
Preguntas
  • Como es mas específicoparaclonar un fragmento de DNA en un vector, con una o con dos enzimas? Porque? Mencioneventajas o desventajas de cada forma.
  • Si unaenzimaviene a 22000 U/ml, cuantos µl necesitoparadigerir 4 µg de DNA?
  • Porquelasbacterias no digierensupropio DNA con susenzimas de restricción?
  • Derive una formula paracalcularcuantosfragmentos de DNA salen de unamolécula de DNA cortada con unaenzima de restricción, si la moléculaes lineal vssies circular?
referencias
Referencias
  • Brooker, Robert J. (2014). GeneticsAnalysis & Principles. (Quinta Edición). New York, McGraw-Hill Companies, Inc.
  • Alberts, et. Al, (2013). Essential Cell Biology, Garland Sciences Publishing, New York.
  • http://www.dnalc.org/resources/animations/restriction.html
  • http://www.restrictionmapper.org/
  • http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/renzymes.html
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