1. 离子和药物对离体蟾蜍心脏活动的影响（ 6.5 学时）离体心脏灌流实验方法和要求讲解（心脏插管视频演示）（ 40min ）同学们实验（ 180min ）数据统计（ 20min ）

本堂课安排：（8学时，360min） • 1.离子和药物对离体蟾蜍心脏活动的影响（6.5学时） • 离体心脏灌流实验方法和要求讲解（心脏插管视频演示）（40min） • 同学们实验（180min） • 数据统计（20min） • 实验讨论（45min） • 2.模拟实验：尿生成的影响因素实验（1.5学时） • 自主实验

注意事项： • 组内人员分工明确 • 实验开始前，要熟悉实验的每个步骤及注意环节 • 标本制备结束，应立即清洗器械、清理桌面 • 实验记录过程中，要避免碰撞、振动实验台和灌流装置 • 数据测量完毕，在本组计算机上的“数据lab5-00/heart perfusion.xls 文件中输入数据并保存。 • 先完成实验的，组织本组同学讨论实验结果，准备在全班讨论时发言。 • 值日：督查各组善后工作；扫地、拖地，凳子放整齐；清洁洗涤台、将动物尸体送动物中心 • 实验报告于2012-4-8 前提交。

离子和药物对离体蟾蜍心脏活动的影响 Effects of Several Drugs and Extracellular Ions on Isolated Toad Heart 陆源（luyuan@zju.edu.cn) 浙江大学医学院

Discussion

讨论 • 请用实验验证细胞外低钙抑制心脏的收缩和舒张 • 请用实验验证细胞外轻度高钾抑制心脏的收缩和舒张 • 请用实验验证乙酰胆碱激动M受体抑制心脏的收缩和舒张 • 请用实验验证肾上腺素激动β受体加强心脏的收缩和舒张 • 实验设计要求：实验方法、数据记录、结果分析、结论

CaCl2 0.0011 mol/L Ca2+ -free Ringer’s solution CaCl2 0.0011 mol/L CaCl2 0.0022 mol/L 假设…… 实验验证……

CaCl2 0.0011 mol/L CaCl2 0.0056 mol/L CaCl2 0.0121mol/L CaCl2 0.0011 mol/L 量效关系非单调性机制的复杂性

假说……. 实验验证……..

实验目的(Objectives)： • 了解离体心脏灌流的方法 • 观察钾、钙离子浓度、肾上腺素、乙酰胆碱对离体蟾蜍心脏活动的影响并探讨作用机制

离体心脏灌流法 Straub法八木氏法 Langendorff法

Langendorff

1. 材料 (Materials) 雄蟾婚垫雄蟾雌蟾 1.1实验动物（laboratory animal) 蟾蜍（中华蟾蜍指名亚种，Zhuoshan Toad）雄性蟾蜍皮肤光滑，前肢趾上有黑色婚垫，会鸣叫。雌性蟾蜍皮肤粗糙，无婚垫，不会鸣叫。

1. 材料 (Materials) 1.1 实验动物中华蟾蜍（Zhuoshan Toad） 1.2 药品与试剂肾上腺素（ adrenaline hydrochloride）,乙酰胆碱（ acetylcholine chloride ），普萘洛尔（propranolol hydrochloride ）,阿托品（atropine sulfate ），氯化钾，氯化钙，任氏液（Ringer’s solution）。

1. 材料 (Materials) RM6240多道生理信号采集处理系统张力换能器 1.1 实验动物中华蟾蜍（Zhuoshan Toad） 1.2 药品与试剂肾上腺素（ adrenaline hydrochloride）,乙酰胆碱（ acetylcholine chloride ），普萘洛尔（propranolol hydrochloride ）,阿托品（atropine sulfate ），氯化钾，氯化钙，任氏液（Ringer’s solution）。 1.3 仪器和装置 RM6240多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂），JZJ01张力换能器(成都仪器厂）。

2. 方法(Methods) 2.1 仪器连接和参数张力换能器接RM6240多道生理信号采集处理系统第1通道, RM6240多道生理信号采集处理系统采样频率：800Hz，时间常数：直流，滤波：30Hz，灵敏度：7.5g。

2.2 离体蟾蜍心脏标本制备 蟾蜍毁脑脊髓，蟾蜍仰卧于蛙板，打开蟾蜍胸腔，暴露心脏，结扎下腔静脉，靠头端结扎左主动脉，在左、右主动脉下穿线，在左主动脉根部剪一斜口，将插管插入动脉圆锥，在心室收缩时将插管插入心室，结扎固定，游离心脏。

2.3 心脏与换能器连接 将蛙心插管固定在夹具上，蛙心夹连线通过滑轮连至张力换能器。蛙心夹在心室舒张期夹住心尖，调节微调使心脏舒张期至1g。

2.4 向插管中加入1ml任氏液，心搏曲线稳定后记录正常的心搏曲线45s。加任氏液25l，稳定45s后。 2.5 无钙任氏液1ml替换插管内的任氏液，心搏曲线稳定后记录45s。再加0.045mol/L CaCl2溶液25l，稳定45s后冲洗。 2.6 用任氏液洗脱3次，加入1ml任氏液，待曲线稳定45s后，向灌流液中加 0.045mol/L CaCl2溶液25l，心搏曲线稳定后记录45s 。 2.7 用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入1ml任氏液，待曲线稳定45s后，在任氏液中加 0.2 mol/L KCl溶液20l，心搏曲线稳定后记录45s 。 2.8 用新鲜任氏液换洗数次，加入1ml任氏液，待曲线稳定后记录45s ，在任氏液中加6×10-6 mol/L 的 acetylcholine（ACh）溶液15l，心搏曲线稳定后记录45s 。再加2×10 –4 mol/L atropine（Atr）15 l，心搏曲线稳定后记录45s 。

2.9 用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入1ml任氏液，待曲线稳定45s后，在任氏液中加6×10-5 mol/L 的 adrenaline（Adr）溶液10l，心搏曲线稳定后记录45s 。 2.10 用任氏液洗脱数次，收缩曲线基本恢复后，加入1ml任氏液，待曲线稳定45s后，在任氏液中加5×10-4 mol/Lpropranolol（Pro）溶液10l，心搏曲线稳定后记录45s ，再加入6×10-5 mol/L 的 Adr 溶液10l，心搏曲线稳定后记录45s 。 2.11 数据测量测量各项处理前后的心率（heart rate，HR)、心脏舒张末张力（end diastolic tension，EDT) 、心脏收缩末期张力(end systolic tension，EST)。 2.12 统计方法结果以x  s 表示，统计采用Student t test方法。

EST EDT

EST EDT +dT/dtmax -dT/dtmax t-dT/dtmax

Tabl 1 Effects of adrenaline,aceytlcholine, potassium and calcium ions on isolated toad heart 注：* p<0.05,**p<0.01 vs control; # p<0.05,## p<0.01 vs 9×10-8M ACh group

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1. 离子和药物对离体蟾蜍心脏活动的影响（ 6.5 学时）离体心脏灌流实验方法和要求讲解（心脏插管视频演示）（ 40min ）同学们实验（ 180min ）数据统计（ 20min ）