Cromberg, Lucas Defelipe, Lucas Mercogliano, Florencia Vazquez, Natalia

1. Cromberg, Lucas Defelipe, Lucas Mercogliano, Florencia Vazquez, Natalia

2. El pasaje de secuencia de DNA a proteína involucra 2 procesos: la transcripción y la traducción. • Co-transcripcionalmente se produce el procesamiento del mRNA para evitar su degradación y lograr una traducción eficiente.

3. Splicing Alternativo (SA) • Es un proceso de edición sobre el mRNA inmaduro. • Permite que a partir de un mismo gen se codifiquen distintas proteínas. • Cerca de un 50% de los productos de los genes humanos son susceptibles de SA.

4. Elementos cis conservados => GU y AG • Branchpoint => A • Sitio rico en pirimidinas. • Ataque nucleofílico del OH de la ribosa de la A al sitio de splicing 5’. • El OH del extremo del exón 1 realiza ataque nucleofílico al sitio de splicing 3’. • Se libera el intron.

5. RNA polimersa II - CTD Mamíferos 52 repeticiones en tándem Levaduras 26 repeticiones en tándem (YSPTSPS)n Drosophila 40 repeticiones en tándem Ser5 inicio de la transcripción Residuos suceptibles a fosforilación por kinasa Ser2 elongación de la transcripción • CTD compuesto por una secuencia aminoacídica altamente conservada YSPTSPS • Sujeto a modificaciones como isomerización y glicosilaciones. • Funciona como plataforma para unir al mRNA los factores de procesamiento. CTD mutado o truncado genera defectos en el capping, clivaje/poliadenilación y splicing del pre-ARNm

6. Marco Teórico Modelo cinético: Las reacciones de SA dependen de la procesividad de la Pol II. Menor procesividad mayor tasa de SA.

7. Marco Teórico Modelo de Reclutamiento: El SA depende de la interacción de la Pol II con diversos factores.

8. Hipótesis La presencia de CTD en RNA pol II inhibe la inclusión de un exón (EDI) en conjunción con la actividad negativa de la proteína SRp20. Hipótesis suplementaria: La cinética es más influyente sobre la inclusión de EDI que la interacción con los factores.

9. Resultados

10. Un primer acercamiento a ∆CTD Minigen “EDI” bajo el control de distintos promotores. Vector con RNA pol II resistente a α-amanitina y el dominio CTD deleteado.

11. ¿Cuál es el efecto de ∆CTD? • El promotor no afecta al splicing alternativo. • ∆CTD afecta al splicing alternativo aumentando la inclusión de EDI. • Pero ¿porqué?

12. Sistema Tet-Off La doxiciclina pertenece a la familia de las tetraciclinas.

13. Estrategia Experimental • La tetraciclina se agrega desde el principio para evitar la expresión de los minigenes. • La α-amanitina inhibe la maquinaria transcripcional endógena.

14. Sistema Tet-off “normal” La proteína quimérica formada por el plásmido tTA-VP16 no puede activar la transcripción en presencia de RNA Pol II ΔCTD. Entonces ¿Qué se utilizó?

15. Sistema Tet-off Modificado La proteína surgida del plásmido tTA-Sp1 puede activar la transcripción de la luciferasa al utilizar la RNA Pol II ΔCTD. Nótese que Sp1 es un activador débil de la transcripción mientras que VP16 es un activador fuerte.

16. ¿Que se cotransfectó? Células Hep3B. El par de plásmidos Tet-Off, uno expresando la proteína quimérica (tTA-Sp1) y otro con el minigen inducible por tetraciclina. Otro plásmido expresando las distintas variantes de la subunidad mayor de la RNA Pol II: WTS, WTRes o ΔCTD. Las células se analizaron luego de 48hs.

17. ¿Afecta el CTD a la inclusión de EDI? Con ΔCTD la inclusión de EDI aumenta varias veces. (Ver calle 6). En las Calles 1, 3 y 5 se observa el conjunto de los efectos de la pol endógena y la agregada con el plásmido. Únicamente en las calles 2, 4 y 6 se observa el efecto provocado por la pol agregada.

18. El efecto de la α-amanitina La α-amanitina reduce el nivel de trascripción de pUHC-EDA en un 90% cuando se utiliza Pol WTS.

19. ¿Afecta la falta de CTD al proceso de splicing en general? La eficiencia del proceso general de splicing no es afectada por la falta de CTD en la RNA Pol II.

20. ¿Las modificaciones del transcripto primario influyen en el splicing alternativo? El efecto de la falta de CTD en la RNA Pol II es independiente del procesamiento de mRNA (Capping y 3’ end processing).

21. Estructura del CTD • ARN pol II composición del CTD = (YSPTSPS)n • n= 26 en levaduras • n= 40 en Drosophila • n= 52 en mamíferos Sonda anticuerpo específico contra el CTD se pueden imnuprecipitar 3 formas • II0= fosforilada en residuos serina • IIA= sin fosforilar • IIB= sin cola por remoción proteolítica

22. Composición del CTD • N-terminal heptadas 1-25, repeticiones consenso • C-terminal heptadas 26-52, degeneradas • Motivo C-Terminal (C-ter) de 10 residuos (ISPDDSDEEN)estabilidad CTD y factor de procesamiento eficiente del ARNm

23. Esquema de Trabajo Células Hep3B Minigen inducible (pUHC-EDA) + Vectores para la expresión de la subunidad larga del RNA pol II (WT res o ∆CTD)+ N ó C-terminal (+/- C-ter) Western Blot Sonda: anticuerpo contra el epitope B10 del CTD ¿Cómo influye su composición en la la estabilidad del CTD?

24. Western Blot • * Mutantes C-ter - se degradan a la forma IIB (180 kDa)

25. RT-PCR radioactiva La composición del CTD no es crucial para la normal inclusión de EDI

26. Longitud de CTD en el splicing Células Hep3B Minigen inducible (pUHC-EDA) + Vectores para la expresión de la subunidad larga del RNA pol II (WT res o ∆CTD)+ CTD sintéticos de distinta longitud Western Blot Sonda: anticuerpo contra el epitope B10 del CTD

27. Splicing de EDI • CTD n=9 => aumento en la inclusión de EDI (menor que pol II ∆CTD) • CTD n=12 => efecto intermedio en la inclusión de EDI • CTD n=19 => reestablece la normal inclusión de EDI Se necesita al menos, un tamaño de 19 repeticiones para el normal splicing de EDI

28. ¿Cuál es la relación de CTD con los factores de splicing? • SRp20 y SF2/ASF son miembros de la familia de proteínas SR . Son factores de splicing. • SRp20 es la única proteína SR que inhibe la inclusión de EDI. • SF2/ASF provoca un aumento de la taza de inclusión de EDI

29. Knock Down

30. Knock Down de SF2/ASF y de SRp20.

31. ¿Qué pasó con EDI? • Knock Down de SF2/ASF reduce la inclusión de EDI, independientemente de CTD. • Knock Down de SRp20 aumenta la inclusión de EDI dependiente de CTD. • CTD es necesario para el funcionamiento de los factores de splicing.

32. Volviendo al Marco Teórico • Existen sitios fuertes y débiles de splicing. • Dependiendo de la tasa de transcripción de la RNA pol II estos sitios pueden ser leídos o no. • En el splicing alternativo uno de los sitios es débil y no es leído por una RNA pol II con alta tasa de transcripción. • Una RNA pol II mutante (C4), con baja tasa de transcripción, ve el sitio débil de splicing y por lo tanto incluye a EDI en el mRNA maduro.

33. ¿Que pasa si transcribo EDI con C4? • Utilización de C4 para observar la inclusión/exclusión de EDI. • C4 y DRB tienen un efecto en la inclusión de EDI mucho menor que siRNA de SRp20. • Esto puede deberse a que es necesario CTD para el funcionamiento de los factores de splicing.

34. El reclutamiento de SRp20 no determina completamente el efecto inhibitorio de CTD en la inclusión de EDI. • 96 hs. después de la transfección, los valores de SRp20 van a estar más reducidos. • Luego de 96 horas ∆CTD pol II y siSRp20 aumentaron la inclusión de EDI a niveles comparables. El efecto de ∆CTD pol II sobre el splicing de EDI puede atribuirse a la imposibilidad de mediar la inhibición de SRp20.

35. El knockdown de SRp20 en CTD pol II NOafecta los niveles de inclusión de EDI. • SRp20 esindependiente del promotor. Células Hep3B cotransfectadas con EDI bajo el control de distintos promotores y con vectores expresando distintas variantes de pol II. La inclusión de EDI es independiente del promotor, pero es dependiente del CTD de la pol II.

36. Se utilizó un minigen con una deleción de 9 nucleótidos en el Exon Splicing Enhancer (ESE). Al estar mutado este sitio SF2/ASF se une con mucha menos afinidad al exón disminuyendo su nivel de inclusión. • Se cotransfectaron Hep3B con pUHC-EDA ESE y vectores conteniendo variantes para la subunidad grande de la pol II. Se agregaron siRNAs contra proteínas SR o contra luciferasa (control negativo). • Estos experimentos se realizaron en ausencia o presencia de SF2/ASF.

37. Con el minigen WTres el knockdown de SRp20 aumenta la inclusión de EDI. Con la polimerasa lenta (C4) este efecto persiste. • Con el CTD deletado no se observa diferencia entre el control y la calle con el siSRp20. SRp20 necesita la presencia de CTD para producir la exclusión de EDI.

38. La cotransfección de un vector que expresa SF2/ASF aumenta el nivel basal de la proporción EDI+/EDI-. • En la WT la presencia de siSRp20 aumenta la inclusión de EDI. • En cambio, cuando la pol II está mutada no se observa variación. siLuc siSRp20 Estos resultados confirman que el efecto de SRp20 depende de la presencia del CTD y no del aumento del nivel basal por la utilización de una pol II mutante.

39. Discusión • La transcripción mediada por la CTD pol II aumenta la inclusión de un cassette alternativo (EDI) sin afectar la eficiencia del splicing. • El CTD influencia el splicing alternativo y es independiente del capping y del procesamiento 3’. • Ambas mitades del CTD pueden restituir el efecto sobre el splicing alternativo en una CTD pol II. • Para lograr un CTD activo y funcional se necesitan 19 repeticiones de 7 aminoácidos, siendo el factor de importancia la cantidad de repeticiones y no la composición. • 22 repeticiones son necesarias para obtener un nivel de splicing similar al de la polimerasa WT. • Para un splicing efectivo debe estar presente el exón enhancer del splicing (ESE). • La proteína SF2/ASF (perteneciente a la familia SR) promueve la inclusión de EDI, pero es independiente del CTD.

40. Discusión La proteína SRp20 (de la familia SR también) inhibe la inclusión de EDI, pero necesita la presencia de CTD. El mecanismo de inhibición mediado por SRp20 no es conocido, sin embargo se proponen 2 hipótesis: puede que exista una interacción con EDI e impida su reconocimiento o puede ser que produzca la exclusión interactuando con los exones vecinos. Se realizaron experimentos de doble híbrido y coinmunoprecipitación para comprender la interacción entre CTD y SRp20 pero no fueron exitosos, ya que dicha interacción física no se pudo establecer. Estos resultados sugieren que de existir la interacción fisíca debe ser muy débil, muy dinámica o indirecta. Tanto el efecto de inhibición o de activación del splicing alternativo son independientes de los promotores utilizados en las construcciones. Evidencia que fortalece la teoría de que el efecto del CTD sobre el splicing alternativo depende más del reclutamiento que de los cambios en la elongación.