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血流感染实验室诊断新进展

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血流感染实验室诊断新进展. 北京协和医院检验科 王瑶 2013 年 4 月 13 日. 内容. 什么是血流感染? 血流 感染流行病学特点 血培养流程优化 提高阳性率 分析培养结果 减少污染 分子生物学 方法检测血流感染 基于 PCR 的技术 MALDI-TOF MS PNA-FISH. 概念. 感染=炎症 + 病原体 全身炎症反应综合征( SIRS ) 体温 >38 ⁰C 或 <36 ⁰ C 心率 >90 次 / 分 呼吸频率 >20 次 / 分,或 PaCO 2 <32mmHg

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血流感染实验室诊断新进展

北京协和医院检验科

王瑶

2013年4月13日

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内容
  • 什么是血流感染?
  • 血流感染流行病学特点
  • 血培养流程优化
    • 提高阳性率
    • 分析培养结果
    • 减少污染
  • 分子生物学方法检测血流感染
    • 基于PCR的技术
    • MALDI-TOF MS
    • PNA-FISH
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概念
  • 感染=炎症+病原体
  • 全身炎症反应综合征(SIRS)
    • 体温>38⁰C或<36 ⁰C
    • 心率>90次/分
    • 呼吸频率>20次/分,或PaCO2<32mmHg
    • 白细胞>12×109/L或<4×109/L,或幼稚细胞>10%
  • 脓毒血症(sepsis)=感染+SIRS,血培养可以阳性或阴性
  • 重度脓毒血症(severe sepsis)=sepsis+脏器功能障碍、组织灌注不良和低血压
  • 感染性休克(septic shock)
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概念
  • 败血症(septicemia):病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征,是一种严重的全身感染。病原菌主要是细菌,也可为真菌、分枝杆菌等。
  • 菌血症(bacteremia):细菌在血流中短暂出现的现象,一般无明显毒血症状,在国外文献中常与败血症通用。
  • 血流感染(bloodstream infection, BSI):败血症和菌血症目前统称为血流感染。
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血流感染
  • 医院获得性血流感染
    • 原发血流感染
      • 实验室证实血流感染(Laboratory-confirmed Bloodstream Infection, LCBI)
      • 临床血流感染(Clinical Sepsis)
    • 继发血流感染:血培养分离出有意义微生物,而且此微生物与另一部位之院内感染有关。唯不包括血管或血管内导管装置所引起之血流感染。
  • 社区获得性血流感染
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实验室证实血流感染(LCBI)
  • 标准一:从一次或多次血标本中培养出一种一致的致病菌,而且培养出的病原体与其它部位的感染无关。
  • 标准二:病人至少具有下列症状和体征之一:发热(>38 ⁰C ),寒颤或低血压,并致病符合下列之一:
    • 1.从两次或两次以上不同部位抽血的标本中培养出皮肤寄生菌(如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌)。
    • 2.至少一次从带血管内导管的病人血标本中培养出皮肤寄生菌群(如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌),并且主管医生开始了适当的抗菌药物治疗。
    • 3.血中抗原检测阳性(如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌或B群链球菌)。与实验室阳性结果一致的症状和体征与其它部位的感染无关。
  • 标准三:年龄<1岁的病人具备下列症状或体征中的至少一项,发热(>38 ⁰C ),低温(<37 ⁰C ),呼吸暂停、脉搏徐缓,并具有下列之一(同上3点略)
clinical sepsis
临床血流感染(Clinical Sepsis)

具有下列二条件之一者:

  • 具有非其它已知原因所引起的发烧、血压过低(收缩压≤90mmHg或收缩压低于平常超过40mmHg),少尿(每小时尿量低于30ml)等临床症状任何一项,且符合下列所有条件者:
    • 未做血培养,或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者
    • 其它部位无明显感染者
    • 医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗
  • 1岁以下婴儿 ,具有非其它书籍原因引起的发烧、体温过低、呼吸中止或心跳过缓等临床症状任何一项,且符合下列所有条件者:
    • 未做血培养,或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者
    • 其它部位无明显感染者
    • 医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗
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BSI流行病学特点
  • BSI发病率逐年增加
  • 凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、真菌血流感染发病率逐年上升,革兰阴性菌下降
  • 耐药菌比例逐年增加
  • 社区获得与医院获得血流感染病原谱存在差异
  • 院内BSI患者病死率高
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+600%

+300%

+300%

美国脓毒血症流行病学

Martin et al, NEJM 2003;348:1546

canword 2002 2009
加拿大CANWORD监测2002-2009

DiagMicrobiolo Infect Dis. 2011; 69: 307

canword 2002 20091
加拿大CANWORD监测2002-2009

Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 307

49 bsi
美国49医院BSI病原谱

CID. 2004, 39: 309-317

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采血量是影响血培养阳性率的独立相关因素
  • CLSI M47-A:每位患者采集2~3套血培养(40~60ml)
  • Surviving Sepsis Campaign Guidelines (Worldwide):抗菌药物治疗前至少采集2套血培养
  • 英国NHS血培养标准:采集2套血培养
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采血量对血培养阳性率的影响

J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047

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采血量和阳性率

非条件致病菌

Routine Set @ Mayo Clinic:

2 BACTEC Aerobic Plus Bottles +

1 BACTEC Anaerobic Lytic Bottle

J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047

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血培养污染菌

  • 在多次血培养中单次培养下列细菌阳性
  • 凝固酶阴性葡萄球菌
  • 棒状杆菌
  • 微球菌
  • 丙酸杆菌
  • 芽孢杆菌
  • 如多次培养阳性,可能为条件致病菌,需结合临床分析
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为什么需氧+厌氧?

两种组合均能检测

非条件致病菌

Pathogen No.

Mayo Clinic

不同的病原菌

(p<0.001)

J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047

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血培养阳性时间-凝固酶阴性葡萄球菌

需氧瓶=242

厌氧瓶=72

需+厌=150

96%(+)

86%单瓶(+)

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如何分析血培养凝固酶阴性葡萄球菌?
  • University Hospital of Base,2003-2007
  • 3060阳性血培养,654CNS,粒缺患者除外
  • 232 (35%)真正BSI,422 (65%)污染
  • BSI由感染科医生判断,至少一份血培养CNS阳性,有感染临床表现
  • SIRS: 体温>38C or <36C; 心率>90/min; 呼吸 >20/min; 白细胞>12 or <4 G/L or >10% 未成熟中性粒细胞
  • 32%患者有1瓶以上CNS阳性,BSI68 %,污染12%(p <0.001)
  • 没有SIRS症状:BSI 5%,污染29%(p <0.001)

ClinMicrobiol Infect. 2012 online

cns bsi
单瓶血培养CNS的BSI和污染患者区别

Clin Microbiol Infect. 2012 online

cns bsi1
单瓶血培养CNS阳性BSI与临床症状相关性

Clin Microbiol Infect. 2012 online

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降低血培养污染率--严格消毒
    • 血培养瓶消毒:70%酒精消毒血培养瓶橡皮塞,待干60秒。或70%异丙醇消毒干燥
    • 皮肤消毒:
  • 三步法
    • 70%酒精擦拭静脉穿刺点 >30秒
    • 1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒:从穿刺点向外画圈消毒,直径>3cm
    • 70%酒精脱碘
  • 一步法
    • 葡萄糖酸洗必泰作用30 s,或70%异丙醇消毒后自然干燥,但不适用于2个月以内的新生儿。
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急诊血培养污染率与工作量相关
  • The University of Michigan Health System急诊
  • 血培养大多数由采血员采集,其次为护士和医生
  • 采血员:病人= 1:9,重症区护士:病人= 2:3,其它区域护士:病人=1:4
  • 年病人量82521人,采集血培养者7586人
  • 11.4%至少1瓶阳性,病原菌阳性率8.0%,污染率3.7%
  • 多套培养患者阳性率7.4%,单套培养阳性率5.1%(p<0.001),污染率无显著差别(2.2% vs. 2.6%)

Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online

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急诊小时工作量

Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online

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繁忙时血培养污染率增加

OR=1.23

OR=0.93

Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online

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抗菌药物治疗与血流感染死亡率

死亡率

Chest 115 (2): 1999

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血培养三级报告制度

鉴定+标准药敏

鉴定菌株

传种培养

革兰染色

血培养

阳性

终报告

电话报告

初步报告 (直接药敏)

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血培养结果回报对治疗的影响
  • A = Appropriate Therapy(正确治疗)
  • I = Inappropriate Therapy(不正确治疗)

ClinInfec Dis 24:584-602, 1997

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血流感染快速分子诊断
  • 分子诊断不受抗菌药物使用的影响
  • 血培养阳性后分子诊断
  • 直接使用血标本进行分子诊断
  • 快速
  • 但不能提供药敏结果
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血培养阳性瓶分子鉴定

Antigone Kotsaki, et al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209

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阳性血培养-基于PCR的检测
  • PCR特异性检测
    • 病原特异性PCR
    • 特定耐药基因检测:葡萄球菌mecA, 肠球菌van
    • 细菌载量:肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数
  • 广谱检测:PCR扩增特定靶位
    • 多态性分析
    • 测序
    • 后续基因检测
    • 种特异性real-time PCR

Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis. 2011, 24(2):137

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qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌
  • Target:ecfX gene
  • 血培养系统:BacT/ALERT,87瓶FA、13瓶FN,涂片均显示G-b
  • 对照方法:氧化酶,API 20E
  • DNA提取:0.5ml肉汤,离心后加裂解液,水煮法
  • 定量PCR:
    • 扩增:Oligonucleotide primers
    • 基因特异性检测:fluorescent-labeled hybridization probes,152bp fragment

AnnalClinMicrobiolAntimicrob 2010, 9:21

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qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌
  • 33瓶pae,敏感性和特异性均为100%
  • 1瓶kpn+pae,由于pae(20CFU/ml)≤kpn (108CFU/ml),PCR(-)
  • 检测限:将ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coli

Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21

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阳性血培养-基于PCR的检测
  • 最常见病原体多重PCR
    • 电泳谱、ELISA杂交、多重Real-time PCR
    • HyplexBloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成
    • Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland):多重real-time PCR+微阵列分析,检测多种病原及mecA,3h完成
    • 多重Real-time PCR

Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.

real time pcr
血培养阳性-多重real-time PCR

NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013

real time pcr1
血培养阳性-多重real-time PCR

NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013

pna fish
血培养阳性-PNA FISH核酸荧光原位杂交
  • 血培养阳性肉汤革兰染色PNA FISH
  • 革兰阴性菌:
  • 商品化试剂盒eco/kpn/pae
  • Efa/其它肠球
  • Sau/scn
  • Cal/cgl/其它念珠菌
  • 报道Salmonella spp.
  • 90min PNA FISH完成

Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301

J Clin Microbiol. 2009; 47: 247

maldi tof ms
MALDI-TOF MS
  • 基质辅助激光解析电离(MALDI)
    • 原理:将样品分散在基质分子中形成结晶后直接进样,当用激光照射结晶时,基质吸收了激光的大部分能量,使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离,成为带电荷的离子。
    • 基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用,使样品带上正电荷或负电荷,成为带电荷的离子
    • 基质会干扰被检测分子质谱峰的大小和浓度;不同类型的分析物选择不同的基质
maldi tof ms1
MALDI-TOF MS
  • 飞行时间(TOF)
    • 原理:离子源产生的离子在加速电场获得动能,当进入高真空无电场飞行管道并在此管道内飞行时,质量较轻的离子飞行速度快,早到达检测器;质量较重的离子飞行速度慢,晚到达检测器。因此依据离子的飞行时间与其质荷比平方根(m/z)成正比的关系,通过测定飞行时间,计算出相应离子的分子量。
maldi tof ms3
MALDI-TOF MS快速鉴定阳性血培养
  • 使用菌落、阳性血培养肉汤鉴定
  • 快速:20分钟(从报警到鉴定出结果)
  • MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD):
    • 正确鉴定:193/213阴性菌(包括厌氧菌)(90.61%),284/319阳性菌(89.02%)
    • 80.9%复数菌正确鉴定出一种,7株缓症链球菌鉴定为spn
  • MALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMérieux):
    • 388个阳性瓶,种正确率91%(包括念珠、厌氧菌)
    • 15瓶复数菌:使用通用库多鉴定出一种,革兰染色后使用阴性或阳性库分析,6瓶鉴定出第二种菌

Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631J Clin Microbiol 2010; 48: 1542

maldi tof ms4
MALDI-TOF MS
  • VITEK MS(bioMérieux)
  • 以16s为金标准,980株临床分离株,ID正确率
    • 肠杆菌科97.7%
    • 非发酵菌92%
    • 葡萄球菌属94.3%
    • 链球菌属84.8%
    • HACEK84%
    • 酵母菌85.2%

JClin Microbiol. 2010; 48: 900

pcr esi ms
PCR/ESI MS
  • 广谱PCR-ESI MS(电喷射质谱)
  • 189阳性血培养和45阴性血培养,种一致率98.7%
  • 6例spn标本方法阴性
  • 提供定量结果--评估病原体载量
  • 假阴性率24%:几乎均由混合感染导致
  • 5-6h完成检测
  • 结合PCR的敏感性和ESI MS特异性
  • 可以直接检测标本,不需要培养

ProcNatlAcadSci. 2005;102:8012

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血标本分子检测
  • 种特异性、属特异性、广谱、多重PCR、微阵列分析
  • 血培养阴性的苛养菌,如Bartonella spp.巴尔通体, Coxiellaburnetii伯氏考克斯体, Mycoplasma spp.支原体, Chlamydia spp.衣原体, Ricketssia spp.立克次体,Tropherymawhipplei
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商品化分子生物学检测方法:血标本
  • SeptiFast®(Roche):multiplex real-time PCR,种属特异性荧光探针,检测重要血流感染致病菌
  • SepsiTestTM® (Molzym):eubacterial and panfungal real-time PCR,a 16S and 18S rRNAgene-based universal PCR+sequencing,几乎可以鉴定所有细菌、真菌
  • VYOO® (SIRS Lab):multiplex PCR,检测重要血流感染菌,电泳分离扩增片段
  • Plex-ID® (Abbott):eubacterial and panfungalPCR+质谱,几乎可以鉴定所有细菌、真菌

Intensive Care Med. 2011 May, publish online.

septi fast test
SeptiFast test检测的病原谱

BMJ Open 2012;2:e000392 Intensive Care Med (2010) 36:49–56

septi fast test1
SeptiFast test评估

Intensive Care Med (2010) 36:49–56

septi fast pct crp
SeptiFast与PCT、CRP相关性

Langenbecks Arch Surg (2012) 397:447–455

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VYOO®检测能力评估

Sepsis

非感染SIRS

血培养阳性

血培养阴性,其它标本培养阳性

Sepsis,所有培养阴性

PLoS ONE. 2012,7 : e38916

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VYOO®
  • 与微生物学一致性为46.2%
  • 仍需改进

PLoS ONE. 2012,7 : e38916

3 pcr
3种商品化PCR检测系统比对

Med KlinIntensivmedNotfmed 2013

3 pcr1
3种商品化PCR检测系统比对

Med KlinIntensivmedNotfmed 2013

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分子生物检测血标本
  • 几乎所有与血培养对照的研究,都显示更高的敏感性,但并非所有血培养阳性菌一定能检测出来
  • 不可替代血培养!
  • 相较于血培养,其高敏感性可以更早地开始抗菌治疗,或改变治疗方案
  • 污染导致的假阳性无法排除!
  • 评估血培养阴性的PCR阳性结果
    • 分析其它微生物检查结果(如BALF,伤口拭子等)
    • 免疫反应指标

Intensive Care Med. 2011 May, publish online.

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小结
  • BSI发病率逐年升高,尤其是革兰阳性菌和真菌
  • BSI病原菌耐药率持续升高
  • 优化血培养流程,提高阳性率,降低污染率
  • 结合临床分析血培养结果
  • 分子生物学技术快速诊断BSI,MALDI-TOF MS、商品化多重PCR检测平台、PNA-FISH成为未来发展方向
  • 血培养不可被分子方法取代!
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