血流感染实验室诊断新进展
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 70

血流感染实验室诊断新进展 PowerPoint PPT Presentation


  • 185 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

血流感染实验室诊断新进展. 北京协和医院检验科 王瑶 2013 年 4 月 13 日. 内容. 什么是血流感染? 血流 感染流行病学特点 血培养流程优化 提高阳性率 分析培养结果 减少污染 分子生物学 方法检测血流感染 基于 PCR 的技术 MALDI-TOF MS PNA-FISH. 概念. 感染=炎症 + 病原体 全身炎症反应综合征( SIRS ) 体温 >38 ⁰C 或 <36 ⁰ C 心率 >90 次 / 分 呼吸频率 >20 次 / 分,或 PaCO 2 <32mmHg

Download Presentation

血流感染实验室诊断新进展

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


2866706

血流感染实验室诊断新进展

北京协和医院检验科

王瑶

2013年4月13日


2866706

内容

  • 什么是血流感染?

  • 血流感染流行病学特点

  • 血培养流程优化

    • 提高阳性率

    • 分析培养结果

    • 减少污染

  • 分子生物学方法检测血流感染

    • 基于PCR的技术

    • MALDI-TOF MS

    • PNA-FISH


2866706

概念

  • 感染=炎症+病原体

  • 全身炎症反应综合征(SIRS)

    • 体温>38⁰C或<36 ⁰C

    • 心率>90次/分

    • 呼吸频率>20次/分,或PaCO2<32mmHg

    • 白细胞>12×109/L或<4×109/L,或幼稚细胞>10%

  • 脓毒血症(sepsis)=感染+SIRS,血培养可以阳性或阴性

  • 重度脓毒血症(severe sepsis)=sepsis+脏器功能障碍、组织灌注不良和低血压

  • 感染性休克(septic shock)


2866706

概念

  • 败血症(septicemia):病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征,是一种严重的全身感染。病原菌主要是细菌,也可为真菌、分枝杆菌等。

  • 菌血症(bacteremia):细菌在血流中短暂出现的现象,一般无明显毒血症状,在国外文献中常与败血症通用。

  • 血流感染(bloodstream infection, BSI):败血症和菌血症目前统称为血流感染。


2866706

血流感染

  • 医院获得性血流感染

    • 原发血流感染

      • 实验室证实血流感染(Laboratory-confirmed Bloodstream Infection, LCBI)

      • 临床血流感染(Clinical Sepsis)

    • 继发血流感染:血培养分离出有意义微生物,而且此微生物与另一部位之院内感染有关。唯不包括血管或血管内导管装置所引起之血流感染。

  • 社区获得性血流感染


2866706

实验室证实血流感染(LCBI)

  • 标准一:从一次或多次血标本中培养出一种一致的致病菌,而且培养出的病原体与其它部位的感染无关。

  • 标准二:病人至少具有下列症状和体征之一:发热(>38 ⁰C ),寒颤或低血压,并致病符合下列之一:

    • 1.从两次或两次以上不同部位抽血的标本中培养出皮肤寄生菌(如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌)。

    • 2.至少一次从带血管内导管的病人血标本中培养出皮肤寄生菌群(如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌),并且主管医生开始了适当的抗菌药物治疗。

    • 3.血中抗原检测阳性(如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌或B群链球菌)。与实验室阳性结果一致的症状和体征与其它部位的感染无关。

  • 标准三:年龄<1岁的病人具备下列症状或体征中的至少一项,发热(>38 ⁰C ),低温(<37 ⁰C ),呼吸暂停、脉搏徐缓,并具有下列之一(同上3点略)


Clinical sepsis

临床血流感染(Clinical Sepsis)

具有下列二条件之一者:

  • 具有非其它已知原因所引起的发烧、血压过低(收缩压≤90mmHg或收缩压低于平常超过40mmHg),少尿(每小时尿量低于30ml)等临床症状任何一项,且符合下列所有条件者:

    • 未做血培养,或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者

    • 其它部位无明显感染者

    • 医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗

  • 1岁以下婴儿 ,具有非其它书籍原因引起的发烧、体温过低、呼吸中止或心跳过缓等临床症状任何一项,且符合下列所有条件者:

    • 未做血培养,或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者

    • 其它部位无明显感染者

    • 医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗


2866706

BSI流行病学特点

  • BSI发病率逐年增加

  • 凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、真菌血流感染发病率逐年上升,革兰阴性菌下降

  • 耐药菌比例逐年增加

  • 社区获得与医院获得血流感染病原谱存在差异

  • 院内BSI患者病死率高


2866706

+600%

+300%

+300%

美国脓毒血症流行病学

Martin et al, NEJM 2003;348:1546


Canword 2002 2009

加拿大CANWORD监测2002-2009

DiagMicrobiolo Infect Dis. 2011; 69: 307


Canword 2002 20091

加拿大CANWORD监测2002-2009

Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 307


49 bsi

美国49医院BSI病原谱

CID. 2004, 39: 309-317


Pumch2012 834

PUMCH2012年834血培养分离株


Pumch2012 144 bsi

PUMCH2012年144株BSI大肠埃希菌药敏结果

ESBL 60.2%


Pumch 2012 67 bsi

PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌药敏结果

ESBL 34.4%


Pumch2012 61 bsi

PUMCH2012年61株BSI鲍曼不动杆菌药敏结果


Pumch 2012 76 bsi

PUMCH2012年76株BSI金黄色葡萄球菌药敏结果


Pumch 2012 46 bsi

PUMCH2012年46株BSI草绿色溶血链球菌药敏结果


2011chif net489 bsi

2011CHIF-NET489株BSI酵母菌


2866706

2011CHIF-NET念珠菌对氟康唑的敏感性


2866706

2011CHIF-NET念珠菌对伏立康唑的

敏感性


2866706

2011CHIF-NET其他酵母菌对氟康唑的敏感性


2866706

2011CHIF-NET其他酵母菌对伏立康唑的

敏感性


2866706

采血量是影响血培养阳性率的独立相关因素

  • CLSI M47-A:每位患者采集2~3套血培养(40~60ml)

  • Surviving Sepsis Campaign Guidelines (Worldwide):抗菌药物治疗前至少采集2套血培养

  • 英国NHS血培养标准:采集2套血培养


2866706

采血量对血培养阳性率的影响

JCM 2007


2866706

采血量对血培养阳性率的影响

J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047


2866706

采血量和阳性率

非条件致病菌

Routine Set @ Mayo Clinic:

2 BACTEC Aerobic Plus Bottles +

1 BACTEC Anaerobic Lytic Bottle

J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047


2866706

血培养污染菌

  • 在多次血培养中单次培养下列细菌阳性

  • 凝固酶阴性葡萄球菌

  • 棒状杆菌

  • 微球菌

  • 丙酸杆菌

  • 芽孢杆菌

  • 如多次培养阳性,可能为条件致病菌,需结合临床分析


2866706

为什么需氧+厌氧?

两种组合均能检测

非条件致病菌

Pathogen No.

Mayo Clinic

不同的病原菌

(p<0.001)

J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047


2866706

表皮葡萄球菌血培养阳性意义

CID 1997


2866706

血培养阳性时间-凝固酶阴性葡萄球菌

需氧瓶=242

厌氧瓶=72

需+厌=150

96%(+)

86%单瓶(+)


2866706

血培养阳性时间-金黄色葡萄球菌


2866706

如何分析血培养凝固酶阴性葡萄球菌?

  • University Hospital of Base,2003-2007

  • 3060阳性血培养,654CNS,粒缺患者除外

  • 232 (35%)真正BSI,422 (65%)污染

  • BSI由感染科医生判断,至少一份血培养CNS阳性,有感染临床表现

  • SIRS: 体温>38C or <36C; 心率>90/min; 呼吸 >20/min; 白细胞>12 or <4 G/L or >10% 未成熟中性粒细胞

  • 32%患者有1瓶以上CNS阳性,BSI68 %,污染12%(p <0.001)

  • 没有SIRS症状:BSI 5%,污染29%(p <0.001)

ClinMicrobiol Infect. 2012 online


Cns bsi

单瓶血培养CNS的BSI和污染患者区别

Clin Microbiol Infect. 2012 online


Cns bsi1

单瓶血培养CNS阳性BSI与临床症状相关性

Clin Microbiol Infect. 2012 online


2866706

Clin Microbiol Infect. 2012 online


2866706

降低血培养污染率--严格消毒

  • 血培养瓶消毒:70%酒精消毒血培养瓶橡皮塞,待干60秒。或70%异丙醇消毒干燥

  • 皮肤消毒:

  • 三步法

    • 70%酒精擦拭静脉穿刺点 >30秒

    • 1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒:从穿刺点向外画圈消毒,直径>3cm

    • 70%酒精脱碘

  • 一步法

    • 葡萄糖酸洗必泰作用30 s,或70%异丙醇消毒后自然干燥,但不适用于2个月以内的新生儿。


  • 2866706

    急诊血培养污染率与工作量相关

    • The University of Michigan Health System急诊

    • 血培养大多数由采血员采集,其次为护士和医生

    • 采血员:病人= 1:9,重症区护士:病人= 2:3,其它区域护士:病人=1:4

    • 年病人量82521人,采集血培养者7586人

    • 11.4%至少1瓶阳性,病原菌阳性率8.0%,污染率3.7%

    • 多套培养患者阳性率7.4%,单套培养阳性率5.1%(p<0.001),污染率无显著差别(2.2% vs. 2.6%)

    Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online


    2866706

    急诊小时工作量

    Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online


    2866706

    繁忙时血培养污染率增加

    OR=1.23

    OR=0.93

    Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online


    2866706

    抗菌药物治疗与血流感染死亡率

    死亡率

    Chest 115 (2): 1999


    2866706

    血培养三级报告制度

    鉴定+标准药敏

    鉴定菌株

    传种培养

    革兰染色

    血培养

    阳性

    终报告

    电话报告

    初步报告 (直接药敏)


    2866706

    血培养结果回报对治疗的影响

    • A = Appropriate Therapy(正确治疗)

    • I = Inappropriate Therapy(不正确治疗)

    ClinInfec Dis 24:584-602, 1997


    2866706

    血流感染快速分子诊断

    • 分子诊断不受抗菌药物使用的影响

    • 血培养阳性后分子诊断

    • 直接使用血标本进行分子诊断

    • 快速

    • 但不能提供药敏结果


    2866706

    血培养阳性瓶分子鉴定

    Antigone Kotsaki, et al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209


    2866706

    阳性血培养-基于PCR的检测

    • PCR特异性检测

      • 病原特异性PCR

      • 特定耐药基因检测:葡萄球菌mecA, 肠球菌van

      • 细菌载量:肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数

    • 广谱检测:PCR扩增特定靶位

      • 多态性分析

      • 测序

      • 后续基因检测

      • 种特异性real-time PCR

    Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis. 2011, 24(2):137


    2866706

    qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌

    • Target:ecfX gene

    • 血培养系统:BacT/ALERT,87瓶FA、13瓶FN,涂片均显示G-b

    • 对照方法:氧化酶,API 20E

    • DNA提取:0.5ml肉汤,离心后加裂解液,水煮法

    • 定量PCR:

      • 扩增:Oligonucleotide primers

      • 基因特异性检测:fluorescent-labeled hybridization probes,152bp fragment

    AnnalClinMicrobiolAntimicrob 2010, 9:21


    2866706

    qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌

    • 33瓶pae,敏感性和特异性均为100%

    • 1瓶kpn+pae,由于pae(20CFU/ml)≤kpn (108CFU/ml),PCR(-)

    • 检测限:将ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coli

    Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21


    2866706

    阳性血培养-基于PCR的检测

    • 最常见病原体多重PCR

      • 电泳谱、ELISA杂交、多重Real-time PCR

      • HyplexBloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成

      • Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland):多重real-time PCR+微阵列分析,检测多种病原及mecA,3h完成

      • 多重Real-time PCR

    Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.


    Real time pcr

    血培养阳性-多重real-time PCR

    NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013


    Real time pcr1

    血培养阳性-多重real-time PCR

    NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013


    Pna fish

    血培养阳性-PNA FISH核酸荧光原位杂交

    • 血培养阳性肉汤革兰染色PNA FISH

    • 革兰阴性菌:

    • 商品化试剂盒eco/kpn/pae

    • Efa/其它肠球

    • Sau/scn

    • Cal/cgl/其它念珠菌

    • 报道Salmonella spp.

    • 90min PNA FISH完成

    Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301

    J Clin Microbiol. 2009; 47: 247


    Maldi tof ms

    MALDI-TOF MS

    • 基质辅助激光解析电离(MALDI)

      • 原理:将样品分散在基质分子中形成结晶后直接进样,当用激光照射结晶时,基质吸收了激光的大部分能量,使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离,成为带电荷的离子。

      • 基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用,使样品带上正电荷或负电荷,成为带电荷的离子

      • 基质会干扰被检测分子质谱峰的大小和浓度;不同类型的分析物选择不同的基质


    Maldi tof ms1

    MALDI-TOF MS

    • 飞行时间(TOF)

      • 原理:离子源产生的离子在加速电场获得动能,当进入高真空无电场飞行管道并在此管道内飞行时,质量较轻的离子飞行速度快,早到达检测器;质量较重的离子飞行速度慢,晚到达检测器。因此依据离子的飞行时间与其质荷比平方根(m/z)成正比的关系,通过测定飞行时间,计算出相应离子的分子量。


    Maldi tof ms2

    MALDI-TOF MS操作步骤


    Maldi tof ms3

    MALDI-TOF MS快速鉴定阳性血培养

    • 使用菌落、阳性血培养肉汤鉴定

    • 快速:20分钟(从报警到鉴定出结果)

    • MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD):

      • 正确鉴定:193/213阴性菌(包括厌氧菌)(90.61%),284/319阳性菌(89.02%)

      • 80.9%复数菌正确鉴定出一种,7株缓症链球菌鉴定为spn

    • MALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMérieux):

      • 388个阳性瓶,种正确率91%(包括念珠、厌氧菌)

      • 15瓶复数菌:使用通用库多鉴定出一种,革兰染色后使用阴性或阳性库分析,6瓶鉴定出第二种菌

    Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631J Clin Microbiol 2010; 48: 1542


    Maldi tof ms4

    MALDI-TOF MS

    • VITEK MS(bioMérieux)

    • 以16s为金标准,980株临床分离株,ID正确率

      • 肠杆菌科97.7%

      • 非发酵菌92%

      • 葡萄球菌属94.3%

      • 链球菌属84.8%

      • HACEK84%

      • 酵母菌85.2%

    JClin Microbiol. 2010; 48: 900


    Pcr esi ms

    PCR/ESI MS

    • 广谱PCR-ESI MS(电喷射质谱)

    • 189阳性血培养和45阴性血培养,种一致率98.7%

    • 6例spn标本方法阴性

    • 提供定量结果--评估病原体载量

    • 假阴性率24%:几乎均由混合感染导致

    • 5-6h完成检测

    • 结合PCR的敏感性和ESI MS特异性

    • 可以直接检测标本,不需要培养

    ProcNatlAcadSci. 2005;102:8012


    2866706

    血标本分子检测

    • 种特异性、属特异性、广谱、多重PCR、微阵列分析

    • 血培养阴性的苛养菌,如Bartonella spp.巴尔通体, Coxiellaburnetii伯氏考克斯体, Mycoplasma spp.支原体, Chlamydia spp.衣原体, Ricketssia spp.立克次体,Tropherymawhipplei


    2866706

    商品化分子生物学检测方法:血标本

    • SeptiFast®(Roche):multiplex real-time PCR,种属特异性荧光探针,检测重要血流感染致病菌

    • SepsiTestTM® (Molzym):eubacterial and panfungal real-time PCR,a 16S and 18S rRNAgene-based universal PCR+sequencing,几乎可以鉴定所有细菌、真菌

    • VYOO® (SIRS Lab):multiplex PCR,检测重要血流感染菌,电泳分离扩增片段

    • Plex-ID® (Abbott):eubacterial and panfungalPCR+质谱,几乎可以鉴定所有细菌、真菌

    Intensive Care Med. 2011 May, publish online.


    Septi fast test

    SeptiFast test检测的病原谱

    BMJ Open 2012;2:e000392Intensive Care Med (2010) 36:49–56


    Septi fast test1

    SeptiFast test评估

    Intensive Care Med (2010) 36:49–56


    Septi fast pct crp

    SeptiFast与PCT、CRP相关性

    Langenbecks Arch Surg (2012) 397:447–455


    2866706

    VYOO®检测能力评估

    Sepsis

    非感染SIRS

    血培养阳性

    血培养阴性,其它标本培养阳性

    Sepsis,所有培养阴性

    PLoS ONE. 2012,7 : e38916


    2866706

    VYOO®

    • 与微生物学一致性为46.2%

    • 仍需改进

    PLoS ONE. 2012,7 : e38916


    3 pcr

    3种商品化PCR检测系统比对

    Med KlinIntensivmedNotfmed 2013


    3 pcr1

    3种商品化PCR检测系统比对

    Med KlinIntensivmedNotfmed 2013


    2866706

    分子生物检测血标本

    • 几乎所有与血培养对照的研究,都显示更高的敏感性,但并非所有血培养阳性菌一定能检测出来

    • 不可替代血培养!

    • 相较于血培养,其高敏感性可以更早地开始抗菌治疗,或改变治疗方案

    • 污染导致的假阳性无法排除!

    • 评估血培养阴性的PCR阳性结果

      • 分析其它微生物检查结果(如BALF,伤口拭子等)

      • 免疫反应指标

    Intensive Care Med. 2011 May, publish online.


    2866706

    小结

    • BSI发病率逐年升高,尤其是革兰阳性菌和真菌

    • BSI病原菌耐药率持续升高

    • 优化血培养流程,提高阳性率,降低污染率

    • 结合临床分析血培养结果

    • 分子生物学技术快速诊断BSI,MALDI-TOF MS、商品化多重PCR检测平台、PNA-FISH成为未来发展方向

    • 血培养不可被分子方法取代!


    2866706

    谢谢!


  • Login