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Introduzione alla proteomica PowerPoint PPT Presentation


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Introduzione alla proteomica. Prof. Mauro Fasano [email protected] http://busto.dipbsf.uninsubria.it/cns/fasano. Il dogma centrale (Un gene = Un enzima). DNA. Trascrizione. RNA. Proteina. Traduzione. Il dogma centrale (Un gene = Un enzima). DNA. RNA. Trascrizione. Proteina.

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Introduzione alla proteomica

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Presentation Transcript


Introduzione alla proteomica

Prof. Mauro Fasano

[email protected]

http://busto.dipbsf.uninsubria.it/cns/fasano


Il dogma centrale(Un gene = Un enzima)

DNA

Trascrizione

RNA

Proteina

Traduzione


Il dogma centrale(Un gene = Un enzima)

DNA

RNA

Trascrizione

Proteina

RNA

Regolazione

Proteina

Proteina


Proteoma

Si definisce proteoma il complemento tempo- e cellulo- specifico del genoma.

Proteome = Proteins encoded by the genome

Il proteoma comprende tutte le proteine espresse nello stesso momento in una cellula allo stesso tempo, incluse tutte le isoforme e le modificazioni post-traduzionali.

Mentre il genoma è costante per una data cellula ed identico per tutte le cellule di un organismo, e non cambia molto all’interno della specie, il proteoma è molto dinamico nel tempo e in risposta a fattori esterni, e differisce in maniera sostanziale tra i diversi tipi cellulari.


Il genoma è costante, il proteoma no…


Proteoma

  • L’insieme di proteine codificate dal genoma

  • Tutte le isoforme, modificazioni, interazioni delle proteine

  • Come sopra, ma in funzione di un certo stato (malattia, trattamento, tempo, ecc.)

    40000 Geni  1 Milione di Proteine


Perché identificare il pattern di espressione proteica ?

  • Non c’è correlazione tra quantità di mRNA e quantità di proteina (Gygi et al., 1999)

  • Il proteoma è un’istantanea del fenotipo a livello biochimico

  • Il proteoma tiene conto del processing delle proteine

S.P.Gygi et al., Mol. Cell. Biol.19, 1720 (1999)


Homo sapiens:6.000.000 kbp

E. coli: 4700 kbp

Se tutto il DNA umano codificasse la sintesi di proteine,

ci sarebbero 10 milioni di proteine, contro le 3000 note

Geni (Esoni, introni, snRPs, RNA catalitico)

Famiglie multigeniche

Genoma

Pseudogeni

Fattori di regolazione

Tandem repeats, sequenze palindromiche


Multigenicità

L’espressione di una singola proteina

dipende da più geni

  • Fattori di trascrizione

  • Enhancers in trans

  • Sequenze di controllo

  • Cromatina

  • Metilazione del DNA

  • Proteine regolatrici

  • Modificazioni post-traduzionali

  • Chaperonine

  • Trasporto e secrezione

  • Degradazione


Pleiotropia

Un singolo gene influenza

il destino di più proteine

La trascrizione e la traduzione del gene avvengono

attraverso il coinvolgimento di proteine che a loro volta

influenzano la trascrizione e la traduzione di altri geni


Variazioni somaclonali

Variazioni indesiderate del genoma che vengono trasmesse alle generazioni successive

  • Instabilità genomica

  • Variazione dinamica del fenotipo


Modificazioni post-traduzionali

  • Acetilazione, metilazione

  • Fosforilazione

  • Glicosilazione (enzimatica)

  • Glicazione (non enzimatica)

  • Nitrazione/denitrazione

  • Cleavage

  • Protein splicing

  • Tagging


La Proteomica studia tutti i complementi proteici, i proteomi, che derivano dai vari tessuti o tipi cellulari.

Al giorno d’oggi, la proteomica può essere divisa in proteomica classica e proteomica funzionale.


Proteomica & Genomica Funzionale


  • La Proteomica classica concentra il suo interesse sullo studio dei proteomi completi, mentre la proteomica funzionale studia gruppi più limitati di proteine.

  • Le tre domande più importanti della proteomica sono:

  • Quali proteine sono presenti in una cellula o in un tessuto?

  • Con quali altre proteine interagisce la mia proteina di interesse (network)?

  • 3) Come appare una particolare proteina (struttura)?


L’APPROCCIO CLASSICO

  • SOLUBILIZZAZIONE DEL CAMPIONE

  • IEF

  • SDS - PAGE

  • VISUALIZZAZIONE DEI RISULTATI

  • ANALISI DEI GEL

  • SPETTROMETRIA DI MASSA (MALDI)


L’APPROCCIO CLASSICO

  • SOLUBILIZZAZIONE DEL CAMPIONE

  • IEF

  • SDS - PAGE

  • VISUALIZZAZIONE DEI RISULTATI

  • ANALISI DEI GEL

  • SPETTROMETRIA DI MASSA

CON UREA 7M, TIOUREA 2M, CHAPS 4%


L’APPROCCIO CLASSICO

  • SOLUBILIZZAZIONE DEL CAMPIONE

  • IEF

  • SDS - PAGE

  • VISUALIZZAZIONE DEI RISULTATI

  • ANALISI DEI GEL

  • SPETTROMETRIA DI MASSA


L’APPROCCIO CLASSICO

  • SOLUBILIZZAZIONE DEL CAMPIONE

  • IEF

  • SDS - PAGE

  • VISUALIZZAZIONE DEI RISULTATI

  • ANALISI DEI GEL

  • SPETTROMETRIA DI MASSA


L’APPROCCIO CLASSICO

  • SOLUBILIZZAZIONE DEL CAMPIONE

  • IEF

  • SDS - PAGE

  • VISUALIZZAZIONE DEI RISULTATI

  • ANALISI DEI GEL

  • SPETTROMETRIA DI MASSA

  • immunoblotting

  • colorazione con Blue di Coomassie o silver staining


L’APPROCCIO CLASSICO

  • SOLUBILIZZAZIONE DEL CAMPIONE

  • IEF

  • SDS - PAGE

  • VISUALIZZAZIONE DEI RISULTATI

  • ANALISI DEI GEL

  • SPETTROMETRIA DI MASSA


L’APPROCCIO CLASSICO

  • SOLUBILIZZAZIONE DEL CAMPIONE

  • IEF

  • SDS - PAGE

  • VISUALIZZAZIONE DEI RISULTATI

  • ANALISI DEI GEL

  • SPETTROMETRIA DI MASSA (MALDI)


  • Principi della 2-D elettroforesi

  • I dimensione

  • Isoelettrofocusing in condizioni denaturanti: separazione in base al punto isoelettrico

  • II dimensione

  • SDS elettroforesi: separazione in base al peso molecolare

Elettroforesi bidimensionale (2-DE)


Vantaggi

• Possibilità di caricare campioni non purificati

• Risoluzione estremamente alta

• I gel 2 –DE sono collettori di frazioni proteiche molto efficienti

• Proteine sono protette all’interno della matrice del gel

Problematiche

• Gradiente di pH

• Limiti nel determinare proteine poco rappresentate

• Capacità di caricare campione

• Proteine idrofobiche

• Proteine ad alto peso molecolare

Elettroforesi bidimensionale (2-DE)


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