第十二章  基因操作、定位与克隆
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第十二章 基因操作、定位与克隆. 第一节 基因操作 一、重组 DNA 技术 (recombinant DNA technique). 2014年11月6日. ( 一) 重组 DNA 两类重要的酶 1 、限制性内切核酸酶 Restriction enzymes 限制性内切核酸酶又称限制酶。限制酶是从核酸分子内部切割 ( 水解断裂 ) 磷酸二酯键生成 DNA 片段的一种内切酶。. A A G C T T T T C G A A. Hin d III from Haemophilus influenz.

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第十二章 基因操作、定位与克隆

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第十二章 基因操作、定位与克隆

第一节 基因操作

一、重组DNA技术(recombinant DNA technique)

2014年11月6日


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(一)重组DNA两类重要的酶1、限制性内切核酸酶 Restriction enzymes 限制性内切核酸酶又称限制酶。限制酶是从核酸分子内部切割 (水解断裂)磷酸二酯键生成DNA片段的一种内切酶。


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A A G C T T

T T C G A A

HindIII

from

Haemophilus influenz

命名:属名、种名、菌株名


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  • HaeⅢ酶的识别序列:

  • 5' GG CC 3'

  • 3' CC GG 5'

  • 酶切位点在GC之间,在对称轴上,产生的片段为平末端。

  • 5 ' GG CC 3'

  • 3 ' CC GG 5'


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  • Pst I酶的识别的序列:

  • 5 ' CTGCAG 3'

  • 3' GACGTC 5'

  • 酶切位点在AG之间,不在对称轴上,产生的片段则为粘性末端。

  • 5 ' CTGCA G 3'

  • 3' G ACGTC 5'


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Sma I CCCGGG

GGGCCC

5’----CCC GGG----3’

3’----GGG CCC----5’

平端


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EcoR I GAATTC

CTTAAG

5’----G AATTC----3’

3’----CTTAA G----5’

粘性末端


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2、DNA连接酶

DNA连接酶

---粘性末端

T4DNA连接酶

---平末端


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(二)重组DNA克隆的载体及选择

特点:

1. 分子量小,结合DNA,可进入宿主细胞并扩增。

2. 酶切位点的特异性

3. 具有筛选标记

4. 具有复制起始点(克隆载体)

或启动子(表达载体)

种类:

质粒; 噬菌体; 粘粒; P1人工染色体;

细菌人工染色体 ; 酵母人工染色体


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DNA克隆的载体

质粒(plasmid) 0~10kb

短片段载体 噬菌体(lambda phage) 0~10kb

( <50kb )粘粒(cosmid) 33~44kb

P1人工染色体(PAC)----- P1和F因子,100kb

细菌人工染色体

大片段载体 (bacterial artificial chromosome,BAC)

-------数十kb~300kb

酵母人工染色体

(yeast artificial chromosome,YAC)

-------1~2Mb

(大分子

DNA克隆)


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  • 1、质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子

    • 理想的质粒

      拷贝数多;

      两三个遗传筛选标志,如抗药性基因:

      抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(terr);β-半乳糖苷酶基因(lac Z) ,

      多个限制酶的单一切点,即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS),多连接子,

      复制起点,Ori


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EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I, Hind III

MCS多连接子

Lac Z

pUC19

(2.69kb)

Ori

Ampr

质粒载体


Plasmid polylinkers and marker genes for blue white screening

Plasmid Polylinkers and Marker Genes for Blue-White screening


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2、λ噬菌体(λphage)和粘粒(cosmid):

  • 粘性质粒(cosmid):

  • 有粘端位点(COS)的质粒

  • 将质粒和λ噬菌体改建的载体

  • λDNA的 cos区+质粒,双链环状DNA,克隆容量:40~50kb

  • 用于高等生物的基因文库


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粘粒

ampr

BamHI

cos

ori

Cosmid vector

37~52kb

insert

BamHI

cos

ampr

Cosmid vector

~5kb

BamHI

cos

cos

insert

ori


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SnaBI

CEN4

SUP4

ARS

pYAC3

11.4kb

TRP1

URA3

TEL

TEL

3、大片段DNA克隆载体

酵母人工染色体--YACs

TEL- telomeric DNA

CEN4- centromere sequence

ARS- 酵母复制起点

TRP1- 与 trp mutant 互补

URA3- 选择基因

SUP4- red-white color test

insert


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(三) 目的基因的获得和检测

1、基因文库(gene library)

DNA文库

是用重组DNA技术和DNA克隆方法人工建立的。包含一个生物体或人的所有DNA序列克隆的集团。


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(1) 基因组文库(genomic DNA library)

血细胞

DNA

Sau酶切消化

与载体重组

转化

选择性增殖


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(2)cDNA文库( cDNA library ):

mRNA 逆转录成cDNA,然后克隆到质粒或噬菌体重组而形成的含有全部cDNA的集团。

(3)染色体特异的基因文库

( chromosome specific library )

亚基因组探针

流式细胞仪、染色体显微切割技术

特异区带重组成黏粒或YAC、BAC文库


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2、基因文库的筛查—杂交分离目的基因

(1)探针的种类

DNA探针

RNA探针

简并探针 人工合成

寡核苷酸探针

单一EST探针 cDNA


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(2)探针的标记

放射性同位素标记:

缺口平移法 随机引物法

(nick translation) (random-primed labeling)

32P、35S、3H

放射自显影

非同位素标记:Bio-11-dUTP(生物素)

Dig-11-dUTP(地高辛)


Dna dna

二、分子杂交分子杂交:应用特异探针在复杂的靶DNA中,根据碱基的互补性来鉴定与其同源的DNA分子片段。


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  • 分子杂交技术方法

    (一)点印迹

  • 1、斑点杂交(dot and slot hybridization)

  • 2、等位基因特异性寡核苷酸杂交

    (allele specific oligonucleotide, ASO)

    (二)Southern印迹法(Southern blot)

    (三)Northern印迹法(Northern blot)

    (四)Western印迹法(Western blot)


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βA βA

βA βs

βs βs

βA βA

βA βs

βs βs

ASO探针斑点杂交鉴定镰型细胞贫血的突变

斑点印迹

杂交

βA -ASO 5′ TG ACT CCT GAG GAG AAG TC 3′

βA5′GTC CAC CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC 3′

合成ASO

Glu

Val

βs5′GTC CAC CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT GCC 3′

合成ASO

βs -ASO 5′ TG ACT CCT GTG GAG AAG TC 3′

杂交

斑点印迹


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基因组DNA

DNA限制片段

含有EB染料的

琼脂糖凝胶

基因组DNA

高盐缓冲液

标准分子量DNA

重 物

玻璃板

吸引滤纸

凝胶

硝酸纤维素膜

与探针杂交的

基因DNA片段

X底片

Southern 杂交法


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CCT-GAG-G

GGA-CTC-C

CCT-GTG-G

GGA-CAC-C

CCTTAGG

GGAATCC

CCTTAGG

GGAATCC

CCTTAGG

GGAATCC

CCTTAGG

GGAATCC

1.2kb

0.2kb

镰型细胞贫血突变MstII片段产生的特异性RFLP

  • Mst II识别的序列为CC↑TNAGG

βA5′-

3′-

- 3′

- 5′

突变

- 3′

- 5′

βs5′-

3′-

酶切、电泳

1.4kb(βs 特异)

1.2kb(βA特异)

βA βA

βA βs

βs βs


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三、聚合酶链反应

PCR


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PCR的原理


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1、

引物

2、

三磷酸核苷

3、

缓冲体系:Mg2+

Taq酶


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第二节 基因定位

  • 基因定位:(gene mapping)

    利用一定的方法将一个基因确定到染色体上的实际位置。


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一、 连锁分析在基因定位中的 作用

(一)连锁分析(linkage analysis)

  • 是最早的传统基因定位方法,又与现代生物技术结合发展为基因作图的基本方法。基因在染色体上呈直线排列,不同的基因在同一染色体上相互连锁。利用这种连锁关系,分析被定位的基因与另一基因在染色体上相互位置而定位。


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连锁分析


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Recomnbination fraction

重组率 1%

遗传图距 1 cM


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(二)遗传标记

1、第一代遗传标记—限制性酶切片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)

2、第二代遗传标记—微卫星DNA

(Micro-satellite DNA)

数目变异的串联重复

(variable number repeat,VNTR)

短串联重复序列

(short tandem repeat,STR)

3、第三代遗传标记—单核苷酸多态性(SNP)


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100/50

60/40

50/60 100/60 100/40 50/40 100/40 50/60 100/40

100

50

40

60

父 母

连锁分析——

1、标记位点必须与致病

基因连锁。

2、标记位点必须具有

多态性。

单基因分析、多基因分析


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连锁分析——


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二、 体细胞杂交与基因定位

  • (一)体细胞杂交在基因定位中的作用

  • 1、细胞融合过程

    细胞膜融合

    细胞质融合 → 异核细胞

    细胞核融合 → 合核细胞 → 杂种细胞


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2、杂种细胞的染色体丢失

  • 杂种细胞在增殖传代过程中,出现保留一方染色体、另一方的染色体则逐渐丢失的现象。

  • 结果产生保存有或多或少人染色体的各种稳定的杂种细胞系。


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3、杂种细胞的选择和分离

  • 细胞融合时,培养中有大量末融合的双亲细胞,这就需要进行选择分离纯化所需要的杂种细胞。为此需要制造一种只让杂种细胞生存而双亲细胞死亡的环境,利用杂种细胞和双亲细胞对生长条件要求和代谢的差异来进行选择。

  • 基本方法是依据基因互补的原理,利用二者对某种药物耐受力的不同,组成一种特异的培养基,即有效的选择系统,把需要的杂种细胞从双亲细胞中选择出来。


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  • 最常用的就是HAT(选择系统)次黄嘌呤(Hypoxanthine)

    氨基喋呤(Aminopterin )

    胸腺嘧啶(Thymine )

  • HAT选择系统是从一种人突变细胞株 (其中含有缺乏HPRT酶的遗传标记)建立了HPRT-系统,选择一种缺乏TK酶的小鼠细胞株的TK-系统,并将二者结合起来发展为HAT选择系统。在正常细胞生物合成途径中,因有氨基蝶呤而阻断DNA合成。两种亲本细胞在HAT培养基中不能生存。

    次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HPRT)

    胸苷激酶(TK)


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  • 将HPRT-人细胞和TK-小鼠细胞进行融合,培养于HAT培养基中。

  • 杂种细胞含有TK酶(人)和HPRT酶(小鼠),就可利用次黄嘌呤转变成次黄核苷酸,鸟嘌呤转变成鸟核苷酸,胸腺嘧啶转变为胸腺嘧啶核苷酸;进而利用这些外源核苷酸通过另一补救途径合成DNA。两种亲本细胞在HAT培养基中不能生存,而杂种细胞却能存活、繁殖被选择分离出来。


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4、利用杂种细胞进行基因定位


Microcell fusion

微细胞融合 (microcell fusion):

  • 1977年Frounier和Ruddle建立了含有单个染色体的微细胞,再与啮齿类细胞融合。

  • 方法是在培养基中加入有丝分裂纺锤体抑制剂,如细胞松弛素B,阻止其形成,使有丝分裂停止,成为一个微核,经过离心形成一个微细胞。


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(二)染色体结构畸变与基因定位

  • 区域定位 (regional assignment)是依据染色体结构畸变的特点,建立只含有特殊的部分人染色体的杂种。

  • 例如:易位杂种和缺失杂种,是由供体细胞只含染色体的易位或缺失的片段与鼠细胞融合而成的杂种细胞。它不含有正常染色体的同源片段。利用这样的杂种才能用作亚染色体定位人序列标签位点或生化标记。

  • 某一蛋白质或酶在含有易位或缺失的染色体杂种细胞中表达与否,就可将编码该蛋白或酶的基因定位于染色体易位或缺失的区段。


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三、 原位杂交和荧光原位杂交

(一)原位杂交

  • 原位杂交是利用放射性同位素(如32p)标记的探针与玻片上中期染色体进行分子杂交,将基因分别定位于染色体或具体区带,是一种直接进行基因定位的方法。

  • 首先制备中期染色体玻片标本,用甲酰胺使DNA变性,再用适当放射性同位素(如32p)标记的探针的进行杂交。然后进行放射自显影。


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  • 优点:

    在已知探针情况下,可作特定DNA片段或基因的区域定位。

  • 缺点:

    在末知基因时,不能进行。

    放射标记易于出现高噪音背景,有时难以区分真正信号和背景噪音。


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二、荧光原位杂交(FISH)

利用生物素或地高辛等非放射性物质标记探针,并通过荧光素偶联的抗原-抗体检测系统,在组织、细胞及染色体上对DNA或RNA进行定性或定位分析。

标记物:

Bio-11-dUTP(生物素)

Dig-11-dUTP(地高辛)


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染色体FISH探针

整条染色体涂染探针

染色体重复序列探针

染色体专一位点探针

基本过程:

1、染色体标本制备

2、探针制备

3、杂交

4、显微观察(染色体分带)


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染色体专一位点探针


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荧光标记探针检测精子


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四、 其他的重要方法

原位PCR

  • 是原位杂交与PCR相结合对基因或特定DNA片段进行定位或检出的方法,即在细胞中或组织切片上对特异的寡核苷酸序列进行原位PCR扩增。

  • 间接法:先进行细胞内目的DNA基因原位扩增,然后用标记的探针进行核酸分子原位杂交以定位检测扩增的DNA的技术,步骤相对较多,需时长,但结果可靠。


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  • 直接法:把同位素或非同位素(常用)标记的核苷(如dig-dUTP及Biotin-dUTP)标记的底物或引物5’未端连接标记物加入PCR反应液中,随着扩增的进行,标记的核苷或引物直接掺入到PCR产物中,而后放射自显影或用免疫组化、荧光检测技术进行DNA定位或检测。


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第三节 基因克隆

  • 基因克隆 (gene cloning)

    把不同位点上的基因再用一定的方法分离出来。

    三种克隆策略:功能克隆、位置克隆、

    候选克隆


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一、功能克隆(functional cloning)

先天性代谢病 血或尿的生化分析 某氨基酸过剩

蛋白酶缺陷

探针 反转录 合成

基因 cDNA mRNA 蛋白质测序

筛选


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二、定位克隆(positional cloning)

基因产物(蛋白质)不明时,定位作图,克隆,功能基因

定位方法:连锁分析---相邻基因或遗传标记

染色体的结构异常---缺失、易位,

断点:定位、克隆

连锁分析 遗传标记

家系系谱 染色体定位 精细定位

染色体异常

突变 转录子

致病基因 候选DNA YAC、BAC克隆片段

筛查 鉴定


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假肥大型肌营养不良(DMD)抗肌萎缩蛋白基因的克隆

XR,疲乏无力,行动困难,死于肌肉变性退行性并发症

用连锁分析和X—常染色体易位定位DMD基因

受累家系 RFLP连锁分析 Xp21

罕见女性患者, X—常染色体易位,断点Xp21.2

t(Xp21;21p)

13、14、15、21、22号短臂含有核糖体RNA基因

已知序列

克隆易位断点处的DAN序列

正常细胞克隆DMD基因


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用缺失定位DMD基因

男患儿 Xp21.2处微小缺失 Xp21

1986年Kunkel等人,

克隆出包含Xp21.2缺失 DNA片段----PERT87系列探针

证明DMD患儿存在Xp21.2处微小缺失

转录子鉴定法

PERT87探针Northern印迹证明

特异肌肉蛋白转录物16kbRNA

反转录 cDNA

钓出 DMD基因

最大人类基因,2300kb,X的1%,79个外显子

编码抗肌萎缩蛋白----影响横纹肌和心肌的结构与收缩


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一名患有DMD、慢性肉芽肿及另外两种X连锁疾病男童

存在Xp21.2的微小缺失


Pert87 7 dmd dna

以PERT87区域的克隆为探针与7名DMD患儿的DNA印迹杂交

RNA印迹杂交比较胎儿骨骼肌细胞与非胎儿骨骼肌细胞


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三、候选克隆(candidate cloning)--位置、表达、功能、同源性

模式生物基因 同源性功能类推

患者候选基因变异 克隆致病基因

Waardenburg综合症I型(WS1---2q35)

pax3 Splotch鼠

同源 变异

paired box基因 同源 表型类似

果蝇

同源 变异

PAX3 Waardenburg

人 综合症I型


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