Bijzondere integratie-manipulatiemogelijkheden
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 14

Bijzondere integratie-manipulatiemogelijkheden PowerPoint PPT Presentation


  • 89 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Bijzondere integratie-manipulatiemogelijkheden. Homologe recombinatie : recA -afhankelijk (zie Deel 3 : klonering in bacteriën) Lysogene faag integratie-systemen : (vereisen extra proteïnen) E. coli l (Int) Pseudomonas f CTX ( Vibrio cholerae ) ( c yto t o x in)

Download Presentation

Bijzondere integratie-manipulatiemogelijkheden

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

Bijzondere integratie-manipulatiemogelijkheden

Homologe recombinatie : recA-afhankelijk (zie Deel 3 : klonering in bacteriën)

Lysogene faag integratie-systemen : (vereisen extra proteïnen)

E. colil (Int)

PseudomonasfCTX (Vibrio cholerae) (cytotoxin)

Faag P1 : Cre-lox systeemCre recombinase (Cyclisationrecombinase)

lox (locus ofcross-over(x))

S. cerevisiae : Flp-FRT systeemFlp recombinase of "flippase"

van het 2-mu plasmide

(Cre en Flp werken zonder accessory proteïnen)

Doelwit : loxP en FRT

34-bp box : 13-bp inverted repeats + 8-bp ertussen

Circulair DNA : insertie

Lineaire DNA's : omwisseling van DNA segmenten


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

Homologe DNA sequenties op eenzelfde DNA molecule

Directe herhalingOmgekeerde herhaling

=> excisie van tussenliggende sequentie

=> omkering van tussenliggende sequentie


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

Resultaat van recombinatie met doelwitten op verschillende DNA-moleculen

Insertie van circulair molecule Uitwisseling tussen lineaire moleculen


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

Integratie van faag l DNA in het E. coli chromosoom

de uiterste gedeelten van attP en attB zijn sterk verschillend

het binnenste gedeelte (15 bp) waar de recombinatie gebeurt, is nagenoeg identisch

de combinatie van P + B' en P' + B vormen attL en attR in de profaag.


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

  • Integratie in bvb. Pseudomonas aeruginosa

P : phage

B : bacterieel

L : links

R : rechts

attP

attB

attL

attR


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

XerC en XerD : twee chromosoom-gecodeerde

recombinasen, die normaal chromosoomdimeren

bij de dif recombinatieplaats resolveren.

De CTX integratieplaats overlapt met dif. De faag

codeert geen eigen integrase. De bacteriële XerCD

recombinasen blijken de faaggenomen te kunnen

integreren in dif-gelijkende plaatsen in diverse

bacteriële species.

(nb. resolutie van ColE1 multimeren tot monomeren

gebeurt bij de cer locus met het E. coli XecC. )


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

Chromosomale lokalisatie voor transcriptieanalyse

  • Transfer van E. coli naar P. aeruginosa (een niet-replicatief plasmide (pMB1 afgeleid))

  •  integrase actief – insertie ter hoogte van attB plaats

  •  gekloneerd gen geïnsereerd in neutrale plaats

  •  Flp recombinase doelwitsequenties (FRT, Flp ‘recombinase target sites’)

  • voor in vivo verwijdering van plasmidesequenties – in aanwezigheid

  • van Flp recombinase


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

Chromosomale lokalisatie voor transcriptieanalyse

  • Nut ?

  • Functieanalyse  expressiestudies door eiwitten te fusioneren aan

  • reportereiwitten zoals b-galactosidase, luciferase

  • - Op plasmide = geen natuurlijke situatie : daarom overdragen naar chromosoom

  • Integratie van niet-replicatief plasmide  selectiedruk vereist (zie eerder) (TcR)

  • Integratie van genfusie op een neutrale plaats

  • Voorbeelden: Integratieve vectoren voor P. aeruginosa

  • pMB1-afgeleide ori

  • tetracycline-resistentiemerker

  • oriT voor conjugatieve overdracht (van E. coli naar P. aeruginosa)

  • att (“attachment sites”) voor P. aeruginosa faag CTX

  • faag CTX integrase (int gen op vector)

  • MCS, geflankeerd door faag T4 transcriptieterminatiesequenties (W)

  • - Flp recombinase doelwitsequenties (FRT, = Flp recombinase target sites)

  • voor in vivo verwijdering van plasmidesequenties – in aanwezigheid

  • van Flp recombinase


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

Chromosomale lokalisatie voor transcriptieanalyse


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

De FRT herkenningssequentie voor Flp recombinasen

consensus sequenties (a, b, c) : omgekeerde herhaling (a, b) waartussen het

recombinatie doelwit ligt (8 bp). (c is niet-essentieel)

Analoog voor loxP, de herkenningssequentie van het Cre recombinase

(heeft niet het c gedeelte) (FIG 15.7)


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

Klonering van PCR-product door in vitro recombinatie


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

Sequentie van loxP plaats ;

excisie of inversie naargelang 2 loxP plaatsen in directe of omgekeerde herhaling staan

nb. Cre-lox werkt efficientst voor excisie ; integratie vereist bijzondere interventies.


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

"Recombineering"

(bvb. de Gateway vectoren)


Bijzondere integratie manipulatiemogelijkheden

NB. gebruik van SceI voor excisie.


  • Login