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Lezione V-VI martedì 18-X-2011

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Lezione V-VI martedì 18-X-2011. corso di genomica. laurea magistrale Biotecnologia Industriale. aula 8 orario : Martedì ore 14.00 - 16.00 Giovedì ore 13.00 - 15.00 non ci sarà lezione martedì 1 e giovedì 3 Novembre. D. Frezza. se vi indignate. Non prendetevela con me !

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lezione v vi marted 18 x 2011

Lezione V-VI martedì 18-X-2011

corso di genomica

laurea magistrale Biotecnologia Industriale

aula 8

orario : Martedì ore 14.00 - 16.00

Giovedì ore 13.00 - 15.00

non ci sarà lezione martedì 1 e giovedì 3 Novembre

D. Frezza

se vi indignate
se vi indignate

Non prendetevela con me !

Certo si potrebbe protestare di più e meglio sullo scarso investimento sulla cultura, ma è un ventennio che nessuno ci investe ed i risultati si vedono

Poca tecnologia nei nuovi investimenti a tutti i livelli

Questo per esempio è un settore in grande sviluppo ma per operarci in Italia non ci sono molti spazi

perch le riflessioni su evoluzione
perché le riflessioni su evoluzione

È come dover parlare di architettura senza

sapere con quali materiali si costruisce

Nell’800 è stato iserito l’uso dell’acciaio

in edilizia(tour Eiffel 1889)

Anche i romani conoscevano il calcestruzzo

ed il ferro però ne producevano di meno

Poi il cemento armato ha permesso strutture

molto più leggere

Senza sapere come sono venuti fuori i genomi la descrizione sarebbe piatta e di difficile comprensione

polarismi scoperta con i sequenziamenti
polarismi scoperta con i sequenziamenti

procarioti ed eucarioti : variazione e conservazione

mettiamo insieme queste due evenienze formamlmente in opposizione.

abbiamo visto che esiste una polarità

una discrepanza logica che appare spesso in natura,

la polarità è compatibile senza dover eliminare una delle due forme polari ?

come possiamo rendere compatibile una contrapposizione così forte?

la risposta la sapete già: è possibile

i meccanismi che rendono possibile abbiamo detto che giocano sulla variabile tempo

gestire il polarismo
gestire il polarismo

salviamo il polarismo utilizzando questa contraddizione,

possono coesistere entrambe: variabilità e conservazione

il primo nei tempi lunghi, il secondo nel tempo breve

Abbiamo già detto: era implicita in Mendel la conservazione

era implicita in Darwin la variabilità delle specie una nell’altra

Sembrava difficile trovare la soluzione

quando è stata scoperta la mutagenesi si è aperta una nuova finestra per interpretare questi due fenomeni!

la variabilit come mutazione
la variabilità come mutazione

In the 1920s, Hermann Muller discovered that x-rays caused mutations in fruit flies. He went on to use x-rays to create Drosophila mutants that he used in his studies of genetics. He also discovered that x-rays not only mutate genes in fruit flies but also have effects on the genetic makeup of humans.[1] The first mutagens to be identified were carcinogens, or cancer-causing substances. Early physicians detected tumors in patients more than 2,000 years before the discovery of chromosomes and DNA. In 500 B.C., the Greek Hippocrates named crab-shaped tumors cancer, meaning crab.

1 Campbell, Neil A. and Jane B. Reece. Biology. 7th ed. San Francisco, CA: Pearson Education, Inc, 2005.

scoperta legata ad un evento tragico
scoperta legata ad un evento tragico

chi scoprì il fenomeno legato alla variabilità genetica se ne accorse associando l’uso di sostanze tossiche belliche ad eventi di trasformazione genetica: le mutazioni

prima Muller con Drosofila e raggi X, poi UV e poi la chimica: mostarda azotata, azoiprite ed altre in seguito, scoperte dalla Charlotte Auerbach

mutagenesi chimica
mutagenesi chimica

The discovery of Mustard Gas by Charlotte Auerbach and Robson

Science. 1947 Mar 7;105(2723):243-7.

The Chemical Production of Mutations.

Auerbach C, Robson JM, Carr JG.

Nature. 1946 Mar 9;157:302.

Chemical production of mutations.

AUERBACH C, ROBSON JM.

Perspectives on genetics: anecdotal, historical, and critical ... - Google Books Result

James Franklin Crow, William F. Dove - 2000 - Medical - 723 pages

June 1993 The Discovery of Mustard Gas Mutagenesis by Auerbach and Robson in ... had been obtained from experiments on chemical mutagenesis prior to 1940. ...

books.google.it/books?isbn=029916604X...

bilanciato il polarismo
bilanciato il polarismo?

possono coesistere variabilità e conservazione

studio dei genomi tramite sequenziamento completo

slancio nella ricerca genomica e sviluppo di nuove tecniche

nuove applicazioni di tecniche già note per sveltire i metodi

i genomi a disposizione
i genomi a disposizione

le nuove evidenze:

procarioti compatti ma senza meiosi (aploidi)

eucarioti con nuove strutture per la diploidia

la complicazione a partire dagli eucarioti unicellulari

lieviti, funghi, (Saccharomyces, Neurospora)

strutture di base invariate già dai procarioti:

RNA, ribosomi, tRNA, polimerasi, membrane,

la conoscenza negli eucarioti
la conoscenza negli eucarioti

strutture paraloghe che assumono nuove funzioni

(omologie analogie)

ma le nuove strutture ancora non si conoscono

si parte dai geni, ma sono il 5%

TUTTO IL RESTO é nuovo e questa è GENOMICA

si sapeva che c’era il DNA ripetuto: trasposoni, regioni GC rich, mini e microsatelliti e poi?

Si consideravano regioni ricche di AT poco informative

i meccanismi dell evoluzione elementare
i meccanismi dell’evoluzione elementare

i processi evolutivi sono lontani da essere compresi nella complessità

alcuni sono evidenti dalle analisi genomiche più semplici

come abbiamo detto i confronti “evolutivi” ci aiutano

i confronti ci parlano del rapporto tra funzione e strutture

i geni divergono e si duplicano
i geni divergono e si duplicano

Geni ortologhi e geni paraloghi

Geni ortologhi: geni simili riscontrabili in organismi correlati tra

loro. Il fenomeno della speciazione porta alla divergenza dei geni e quindi delle proteine che essi codificano.

es. la -globina di uomo e di topo hanno iniziato a divergere circa 80 milioni di anni fa, quando avvenne la divisione che dette vita ai primati e ai roditori. I due geni sono da considerarsi ortologhi.

Geni paraloghi: geni originati dalla duplicazione di un unico gene nello stesso organismo.

es. -globina e -globina umana hanno iniziato a divergere in

seguito alla duplicazione di un gene globinico ancestrale. I due geni sono da considerarsi paraloghi.

variabilit per divergenza

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variabilità per divergenza

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1

alla scoperta del genoma
alla scoperta del genoma:

allontanandosi dai geni

(cod. geni < del 5% del genoma)

ricerca delle funzioni: analogia con il periodo precedente alla scoperta del codice genetico

interpretazioni: studi attraverso i confronti su modelli

i modelli sono validi perchè è esistita l’evoluzione

conclusione: il genoma è dinamico a breve e lungo termine

come ha fatto ad attrezzarsi per poter evolvere?

come mai si usano organismi modello ribadiamolo
come mai si usano organismi modello: ribadiamolo
  • è possibile perchè ci sono:
  • i geni ortologhi (stessa origine nell’ancestrale e divergenza nelle specie successive), hanno la stessa funzione nelle specie diverse
  • i geni paraloghi derivano da duplicazioni e possono mantenere funzioni simili (DNA binding, kinasi ecc.)

(l’evoluzione rimane la premessa inevitabile)

l unica spiegazione sembra autocelebrativa tautologica
l’unica spiegazione sembra autocelebrativa, tautologica

il genoma non poteva esistere senza interazione (per definizione)

se la vita è nata nel mondo ad RNA e poi è venuto il DNA ed ha cominciato ad interagire con proteine diventandone dipendente, ma anche il responsabile, l’informazione genetica non poteva non essere dinamica.

come sarebbe il genoma non interattivo?

da dove parte l interattivit del genoma
da dove parte l’interattività del genoma

non c’è funzione che non preveda interazione con altre strutture ed enzimi, l’informazione passa attraverso interazioni

  • potrebbe risultare passivo quando deve essere replicato/duplicato; la struttura rende possibile ogni altra funzione che già conosciamo o che è ancora da individuare
  • - sembra passivo ma non lo è nemmeno per la sintesi dell’mRNA, manda segnali e ne riceve continuamente

cambia strutturalmente : per il differenziamento: epigenetica

meiosi: gameti: zigote: embrione: adulto

interazione del genoma nelle varie fasi
interazione del genoma nelle varie fasi

sotto il nome della regolazione

la struttura (anatomia)

informazioni per le funzioni

anche solo per la trascrizione la cromatina si altera

la trasformazione inizia molto prima della trascrizione

trascrizione = una delle funzioni finali

non c soluzione di continuit
non c’è soluzione di continuità

l’interazione non è saltuaria

tutto il ciclo vitale di ogni organismo prevede interazione dinamica

ad ogni passaggio il DNA-cromatina subisce trasformazione, alterazioni

dallo zigote alle mitosi al differenziamento, ogni fase prevede quella successiva,il genoma riceve messaggi continuamente per sapere se fermarsi, procedere e cambiare funzioni

ovvio ma fondamentale
ovvio ma fondamentale

l’interazione genoma “ ambiente “ è continuo

gli stimoli devono permettere la reattività

ci deve essere esecuzione del programma

ci deve essere flessibilità

il programma può andare avanti se c’è “feedback”

bidirezionalit della trasformazione funzionale
bidirezionalità della trasformazione funzionale

genoma (cromatina)

ambiente: nucleo, citoplasma,

extracellulare.....ecc.

quando il genoma si attiva è perchè c’è l’ambiente giusto per far partire determinate funzioni

come si inserisce la variabilit
come si inserisce la variabilità

le differenze esistono, si sono accumulate,

ad ogni meiosi si rimescolano

ogni organismo che nasce ha un genoma “ricombinante”

cosa comporta questa diversificazione ?

microvariabilit
microvariabilità

i polimorfismi :

genetica quantitativa

Interattoma modulabile (non solo tra proteine)

modulazione dovuta ad effetti dei polimorfismi

(osservati col confronto tra fenotipi/genotipi)

turn-over (rapidità-lentezza)

effetti a cascata (attivazioni tramite trasformazioni post-traduzionali: fosforilazioni, metilazioni, glicosilazioni ecc.)

trasduzione del segnale tipica dell’interazione intra-extra cellulare e citoplasmatica - nucleare

dal nucleo al genoma e viceversa (ciclo continuo)

andata e ritorno
andata e ritorno

l’informazione arriva all’informatore e riparte

(difficile separare i ruoli nel ciclo continuo)

è un artificio porre un inizio e scegliere lo zigote come start-point, si potrebbero prendere i gameti o le gonadi o l’individuo adulto

la trasduzione del segnale mette in comunicazione le varie parti della cellula e quindi dell’organismo

ogni punto di un ciclo può essere scelto come inizio o fine

adesso prendiamo il genoma come nostro riferimento

come possiamo approcciare il genoma in maniera globale

la post genomica di gi
la post genomica (di già?)

dopo il sequenziamento dei genomi interi

ancora una volta si scopre di non sapere

è l’inizio del salto verso la genomica regolativa /

o dello studio del genoma non tradotto

è riduttivo credere che si conosca il genoma conoscendo solo la porzione codificante

conseguenza: una parte del trascrittoma non è noto ignorando una bella parte delle funzioni del genoma

post genomica non significa che la genomica sia superata,

va capito che non basta conoscere le sequenze genomiche

approcci globali e olistici
approcci globali e olistici

nuove metodologie

trascrittoma

proteoma - interattoma

ma il restante 95%?

95% ? wide genome screening

screening con tecniche diverse

studio nuovo
studio nuovo

cosa si può analizzare

in che maniera

genomica obbligatoriamente porta al confronto tra i vari possibili organismi modello o intraspecie

centralità del modello umano oppure riferimento al modello umano (ricchezza di polimorfismi)

ricerca di modelli per trovare semplificazioni e generalizzazioni

cosa si vuole vedere
cosa si vuole vedere ?

come sempre: strutture e variabilità

micro-arrays per ibridazione

resequencing shot-gun parziali o globali

SNPs e VNR

ogni 500 bp del genoma

i vari approcci
i vari approcci

i diversi modelli permettono di produrre i nuovi approcci e le diverse tecniche

dalle domande generali a quelle più specifiche verso i meccanismi sottostanti

allargare l’interattoma anche alla interazione col genoma

pensare in maniera globale

cercare di essere onnicomprensivi (presuntuoso ma necessario)

il problema globale
il problema globale

rischio di genericità tutto o niente

lo studio con le libraies è stato l’inizio

i metodi globali: osservazioni col grand’angolo

necessità di non perdere anche i particolari

guardare dal satellite ma con una risoluzione altissima

osservazione diretta e indiretta
osservazione diretta e indiretta

in quasi tutte le scienze si passa alla oservazione indiretta

il DNA o le proteine non le vediamo, abbiamo prove indirette

ci fidiamo delle osservazioni indirette ed il metodo passa attraverso l’uso dei controlli ossia della contraffabilità del risultato

ancora di più vale per bioinformatica in cui si lavora sotto simulazione

convergenza delle osservazioni e riprove
convergenza delle osservazioni e riprove

l’uso di organismi modello come riprova della universalità

osservazioni riproposte anche su organismi di specie diverse

difficoltà di riscontrare patologie in organismi molto diversi

possibilità di osservare fenotipi simili in organismi anche molto diversi

generalità di un fenomeno riscontrabile su altre specie

(quanto più è generale)

troppi esempi
troppi esempi

a riprova dell’universalità dei promotori eucariotici e procariotici : tutti i costrutti inducibili o costitutivi transfettati

cosa possiamo fare per capire il genoma nell’era

post-genomica

mantenere la capacità di analisi nelle interazioni / variazioni

nel contesto e fuori contesto

in vitro veritas

fenotipi mutanti e polimorfismi
fenotipi mutanti e polimorfismi

come può essere l’approccio sperimentale?

dove si guarda: nei possibili target (regioni predette) o con un sistema non “bias” onnicomprensivo senza selezione

cercando le funzioni genomiche

creazione di esche per trovare con cosa interagiscono

riprova in vivo con l’organismo transgenico per avere una conferma

approccio simmetrico
approccio simmetrico

da un fenotipo ricerca del fenomeno da riprodurre in vitro

verificare se lo stesso costrutto interagisce con le stesse proteine

Esempio: tentativi non sempre di successo con two-hybrid systems, le tecniche hanno delle approssimazioni

esca e oggetto interagente (isolamento e conferma in vitro)

transcription factories
transcription factories

Passando alla struttura del genoma, nuove tecniche ed ipotesi

Simposio sulla struttura e funzioni del genoma

Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology

CSH 17 maggio 2011, vol. LXXV

CH Eskiw, NF Cope, I Clay, S Schoenfelder, T Nagano and P Fraser.

Laboratory of Chromatin and Gene Expression, The Babraham Institute, Cambridge CB22 3AT, United Kingdom Correspondence: [email protected]

abstract transcript fact cshq
abstract transcript fact.CSHQ

The dynamic compartmental organization of the transcriptional machinery in mammalian nuclei places particular constraints on the spatial organization of the genome. The clustering of active RNA polymerase I transcription units from several chromo- somes at nucleoli is probably the best-characterized and universally accepted example. RNA polymerase II localization in mam- malian nuclei occurs in distinct concentrated foci that are several-fold fewer in number compared to the number of active genes and transcription units. Individual transcribed genes cluster at these shared transcription factories in a nonrandom manner, pref- erentially associating with heterologous, coregulated genes. We suggest that the three-dimensional (3D) conformation and rel- ative arrangement of chromosomes in the nucleus has a major role in delivering tissue-specific gene-expression programs.

riassunto art eskiw fraser
riassunto art. Eskiw- Fraser

Il sistema dinamico della compartimentazione della macchina della trascrizione nel nucleo dei mammiferi pone dei limiti alla organizzazione spaziale del genoma. La localizzazione delle unità attive di trascrizione della RNA pol I di parecchi cromosomi nei nucleoli è l’esempio meglio caratterizzato ed accettato universalmente.

I foci della RNA pol II concentrati nei nuclei di mamm. sono di meno rispetto al numero di geni ed alle unità di trascrizione. Unità di trascrizione di cluster di geni sono associate in maniera non random a “transcription factories” condivise in preferenza con geni eterologhi coregolati. Suggeriamo che la conformazione 3D e arrangiamenti relativi dei cromosomi nel nucleo abbiano un ruolo importante per attivare programmi di espressione genica tessuto specifica.

introduzione dell articolo
introduzione dell’articolo

Nella introduzione si parla di molti argomenti di questo corso di genomica. E’ grande interesse però è una storia che vi dovete leggere voi e di cui in gran parte vi ho già parlato nelle lezioni introduttive sulla genomica, per definirla ed identificarla.

differente conoscenza
Differente conoscenza

Tra nucleo e citoplasma

del nucleo si sa abbastanza poco: nucleolo, nucleoplasma, membrana interna/esterna, pori, cromatina (eu-etero), ribosomi, ~matrice nucleare

del citoplasma: vacuoli, RE, centrioli, lisosomi, mitocondri, Golgi app., vescicole, citosol, citoscheletro, pori etc.

attivit trascrizionale dei geni
attività trascrizionale dei geni

Trascrizione dei geni più attivi discontinua e ad impulsi

Geni singoli alternano brevi periodi ad alta attività trascrizionale a periodi inattivi di durata variabile.

Il 90% degli alleli di  e  globina sono attivi allo stadio corretto con analisi FISH (fluoresc. in situ hybridization)

Topi transgenici con LCR deleta mostrano un pattern on / off dinamico suggerendo che la presenza stabilizzi lo stato on.

Tutte le cellule esprimono un basso livello di globina, ma solo una frazione mostra segnali di trascrizione con RNA FISH.

Per la maggior parte degli altri geni con FISH con sonde introniche si vede che geni attivi sono “off” per la maggior parte del tempo. (LCR = locus control region)

conseguenze regolative
conseguenze regolative

La conseguenza di questi stadi di inattività prolungata è che questi geni possono essere modulati variando i livelli di espreessione genica alternando dinamicamente le fasi “on” e fasi “off”.

Molto diverso che non modulare una fase di trascrizione continua rallentandola o accelerandola.

geni associano dinamicamente con transcription factories
geni associano dinamicamente con“transcription factories”

Le TF (transcription factories) sono foci nucleari discreti che contengono alte conc. di RNA pol II fosforilata e sti di produzione di RNA nascente.

Analisi di geni singoli con immuno-FISH mostra invariabilmente segnali associati ai foci di RNApol II con la nascente sintesi di RNA nelle TF.

Analisi con immuno-FISH mostrano che gli alleli inattivi di geni attivi sono lontani dalle TF.

la cromatina dinamica nei territori occupati
la cromatina dinamica nei territori occupati

Ipotesi :

la dinamica della cromatina porta molti geni in attività a ricollocarsi fuori dai territori cromosomici

I geni perciò si muovono in TF preassemblate quando sono attivi ?

Inoltre i movimenti dinamici della cromatina hanno un ruolo nella regolazione della trascrizione muovendosi dentro e fuori dalle TF?

gene modello globina
gene modello -globina

Tecnica RNA-FISH

cellule eritroidi in fase di maturazione

associazione di quasi tutti gli alleli nelle TF

Doppia marcatura di geni lontani attivi dello stesso cromosoma associano e condividono gli stessi TF dei geni della globina ad alte frequenze.

Geni a megabasi di distanza colocalizzano al 40-50% di più di una localizzazione random.

Colocalizzazione di geni distanti con un’altra tecnica: 3C chromosome conformational capture.

altre evidenze con linfociti b murini
altre evidenze con linfociti B murini
  • Linfociti B murini “resting” di milza esprimono alti livelli di IgH
  • Quasi tutti i loci delle catena IgH mostrano segnali RNA-FISH associati a TF
  • è un sist. modello come la  globina per le cellule eritroidi
  • induz. di geni early (Fos, Myc) in B resting
    • Fos e Myc non erano espressi al t.0
    • dopo 5 minuti la > parte di alleli F e M erano trascritti ed associati nei foci con RNA pol II; al 30% Fos sta a ~30 Mb dal locus IgH sul chrms 12 di topo
    • Myc sul crms 15 risulta al 25% nelle TF del locus IgH
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