通性
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通性 CAM 植物アイスプラントの プラスチド包膜リン酸輸送体の機能解析 PowerPoint PPT Presentation


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通性 CAM 植物アイスプラントの プラスチド包膜リン酸輸送体の機能解析. 理工学研究科分子生物学専攻 指導教官:大西 純一 野明 千雪. 4 種類のプラスチド型リン酸輸送体. Cytosol. CO2. Plastid. ショ糖. カルビン回路. TPT. トリオース リン酸. トリオース リン酸. ペントース リン酸. 無機リン酸. 無機リン酸 . 解糖系. PPT. ホスホエノール ピルビン酸. エリトロース 4 - リン酸. ホスホエノール ピルビン酸. 脂肪酸合成. 芳香族アミノ酸 合成. XPT. キシルロース

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通性 CAM 植物アイスプラントの プラスチド包膜リン酸輸送体の機能解析

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Presentation Transcript


Cam

通性CAM植物アイスプラントのプラスチド包膜リン酸輸送体の機能解析

理工学研究科分子生物学専攻

指導教官:大西 純一

野明 千雪


Cam

4種類のプラスチド型リン酸輸送体

Cytosol

CO2

Plastid

ショ糖

カルビン回路

TPT

トリオース

リン酸

トリオース

リン酸

ペントース

リン酸

無機リン酸

無機リン酸 

解糖系

PPT

ホスホエノール

ピルビン酸

エリトロース

4-リン酸

ホスホエノール

ピルビン酸

脂肪酸合成

芳香族アミノ酸

合成

XPT

キシルロース

5-リン酸

キシルロース

5-リン酸

酸化的

ペントース

リン酸経路

トリオース

リン酸

トリオース

リン酸

GPT

グルコース

6-リン酸

グルコース

6-リン酸

NADH

デンプン

ショ糖


Cam

高等植物のプラスチド型リン酸輸送体ファミリーの基質特異性


Cdna cam

アイスプラントのプラスチド型リン酸cDNAとCAM化に伴う発現量変化


Cam

組替えタンパク質の作成

4種類のアイスプラントリン酸輸送体(McPT)のクローニング

McPTのcDNA断片をPCR法で増幅し酵母発現用vectorpYES2に組込み、酵母細胞INVSc1を形質転換                    → TPT1・GPT1・GPT2  ○                       PPT1×

3種類の形質転換体で目的タンパク質の誘導発現

形質転換体の細胞を破砕して細胞粗抽出液を調製


Liposome

liposome再構成

発現ベクター

タンパク質誘導発現

脂質

輸送体の基質

sonication

酵母質転換体

細胞を破砕して

粗膜画分抽出

Freeze-thaw法

Liposome内に交換基質を封入

(内部基質)

目的タンパク質

目的タンパクを人工膜に組込む


Cam

取込み活性測定方法

32P

32P

32P

32P

25℃

インキュベーション

32P

一定時間経過後

阻害剤を添加して

取込み反応を停止

32P

取込み反応

外部基質として

[32P]無機リン酸を加える

32P

32P

32P

取込まれた

32P量を測定

32P

32P

イオン交換カラムに通し

取込まれなかった[32P]を除去

阻害剤


Cam

無機リン酸の交換輸送活性

INVSc1-pYES2

INVSc1-pGPT1

◆:Pi

□:KCl (control)

INVSc1-pGPT2

INVSc1-pTPT1


Mctpt1 mcgpt2

McTPT1とMcGPT2の基質特異性


Mctpt1

McTPT1の無機リン酸輸送の速度論的解析

Eadie-Hofstee plot


Mcgpt2

McGPT2の無機リン酸輸送の速度論的解析

Eadie-Hofstee plot


Cdna cam1

アイスプラントのプラスチド型リン酸cDNAとCAM化に伴う発現量変化


Cam

アイスプラント葉組織から抽出した再構成膜タンパク質の輸送活性

■:Pi

▲:TP

○:G6P

●:PEP

◆:control


Cam

まとめ

・アイスプラントのTPT1およびGPT2はリン酸輸送機能を持っており、アミノ酸配列の相同性から予想された基質特異性を持つことが確認された。

・無機リン酸輸送のKm値はTPT1=0.8±0.1 mM、GPT2=1.5±0.1 mMであることが示された。

・葉組織の膜タンパク質を再構成した系で、発現の変化に対応する輸送活性の変化が確認できるかもれない。


Cam

謝辞

 谷口光隆 先生

(名古屋大学生命農学研究科)

細胞生化学研究室の皆様

本研究をするにあたりお世話になりました、

これらの方々に感謝いたします。


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