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Experimentelle Methoden zur Bestimmung von Protein-Protein Wechselwirkungen

Experimentelle Methoden zur Bestimmung von Protein-Protein Wechselwirkungen. Presented by Stefan Nickels (stefan-nickels@arcor.de) Proseminar: Theoretical Analysis of Protein-Protein Interactions SS04. Übersicht. Einführung 3 Arten von experimentellen Methoden Physikalische Methoden

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Experimentelle Methoden zur Bestimmung von Protein-Protein Wechselwirkungen

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  1. Experimentelle Methoden zur Bestimmung von Protein-Protein Wechselwirkungen Presented by Stefan Nickels (stefan-nickels@arcor.de) Proseminar: Theoretical Analysis of Protein-Protein Interactions SS04

  2. Übersicht • Einführung • 3 Arten von experimentellen Methoden • Physikalische Methoden • Library basierte Methoden • Genetische Methoden • 3 ausgewählte experimentelle Methoden • FRET • NMR chemical shifts • NMR-based protein docking • Referenzen • Diskussion

  3. Was will man bestimmen? • Auffinden von Proteinen, welche mit anderen wechselwirken • durch meist transiente aber auch persistente Bindung • Bindungskonstante Ki • Thermodynamische Gleichgewichtsgröße • Gibt an welcher Anteil des Liganden im Mittel an Protein gebunden • Je kleiner Ki desto stärker Protein-Ligand Bindung • Freie Bindungsenthalpie ∆G

  4. Physikalische Methoden I • Methodik • Bestimmung von Wechselwirkungen unter Zuhilfenahme von physiko-chemischen Eigenschaften der Wechselwirkungspartner • Beispiele • Protein Affinity Chromatography • Affinity Blotting • Imunnoprecipitation • Cross-Linking

  5. Physikalische Methoden II • Affinitätschromatographie • Um bindende Liganden zu finden • Immobilisierung des Proteins in der Säule auf einer Matrix • z.B. mittels GST Fusionsproteine • Proteine werden mit GluthationS-Transferase markiert • Dieses bindet an Gluthation-Agarose-Matrix • Zugabe des Ligandengemischs • Bindende werden zurückgehalten, nicht bindende fließen durch • Komplexe können ausgewaschen werden

  6. Library basierte Methoden I • Methodik • Suche nach Bindungspartnern für gewisses Protein inGen-Expressions-Bibliotheken • Vorteile • Schnelles Screening einer große Menge von möglichen Liganden • Gensequenzen der Bindungspartner sind sofort verfügbar • Nachteil • Müssen i.d.R. mit Biochemischen Methoden verifiziert werden • Beispiele • Protein Probing • Phage Display • Two-Hybrid Sytem

  7. Library basierte Methoden II • Two Hybrid System • Modularer Aufbau von Transkriptionsfaktoren • DNA-binding domain • Activation domain • Nicht kovalente WW hinreichend für Funktion • Erstellen von sog. Hybriden • Protein X + DNA-binding domain • Protein Y + Activation domain • Wechselwirkung von X und Y • Domänen bilden funktionellen Aktivator für Reportergen=> Expression • Screening von Activator domain markierten Transkripten einercDNA-Library

  8. Genetische Methoden I • Methodik • Nicht WW zwischen Proteinen werden bestimmt • Sondern WW zwischen Genen werden betrachtet • In vielen Fällen interagieren dann auch die Genprodukte • Oder Suche nach Gen-Gen-WW um Protein-Protein-WWzu bestätigen • Beispiele • Extragenic Suppressors • Synthetic Lethal Effects • Overproduction Phenotypes • Unlinked Noncomplementation

  9. Genetische Methoden II • Extragenic Suppressors • Suppressormutationen gleichen durch natürliche Mutationen hervorgerufene phenotypische Defekte aus • Beobachtung:Suppressormutationen treten bei Genen auf, deren Genprodukte mit Genprodukten der mutierten Gene wechselwirken • Aufspürung wegen Suppressormutationen interagierenden Genproduktendurch z.B.: • Kontrolle der Zellzyklen

  10. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy I • Zielsetzung • Beobachtung von Protein-Protein WW bei Abständen > 100 Å • Betrachtung von Proteinen in Zellen in vivo • Proteine müssen mit Flurophoren gelabelt werden • FRET • “molecular ruler” • Bestimmung von Distanzen zwischen Molekülen • Viele verschiedene FRET-Methoden • Hier:Bestimmung der Interaktion von kolokalisierten Proteinen imlichtmikroskopisch detektierbaren Bereich • Detektion Normalerweise spektroskopisch • Hier lichtmikroskopisch

  11. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy II • Funktionsprinzip • Man macht sich den Effekt des Energie Transfers zwischen zwei bestimmten benachbarten Fluorophorpaaren zu nutzen • Wird ein Fluorophor (Donor) durch Licht bestimmter Wellenlänge angeregt, so fluoresziert er • In gewissem Abstand zu einem sog. Akzeptor-Fluorophor, überträgt der Donor Energie (Photon) auf diesen Akzeptor • Durch den Transfer Unterbindung der Fluoreszenz-Resonanz des Donors, stattdessen Fluoreszenz des Akzeptors (Quenching) • Mittels Fluoreszenz-Mikroskopischen Aufnahmen kann die Löschung der Fluoreszenz-Resonanz des Donors dokumentiert werden

  12. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy III • Die Effizienz dieses Enegie-Transfers ist abhängig von der Distanz r der beiden Fluorophore • R0 ist der sog. Förster-Radius • spezifisch für jedes Donor-Akzeptor-Paar, i.d.R. zwischen 10 und 70 Å • Maß für den Grad der Überlappung von Donoremission und Akzeptoranregungsspektrum • kein FRET bei Abständen > 2R0 • Quantifizierung der Transfer-Effizienz über das Ausmaß der Donor-Emissions-Löschung • IDA = Intensität der Donor Fluoreszenz in Anwesenheit des Akzeptors • IDA†= Intensität der D. Fluoreszenz in Anwesenheit von photogebleichtem A.

  13. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy IV • Experiment • Untersuchung von WW zwischen Proteinen in der Plasmamembran • Fluorophor-Paar • Labeling entweder direkt oder mittels Immun-Fluoreszenz-Markierung • Hier Transfektion von Kaninchen-Nieren-Zellen mit der 5‘-Nucleotidase aus der Leber von Ratten • Markierung der Nucleotidasen mit einer Mischung aus Cy3 / Cy5 markiertenIgG-AntiKörpern

  14. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy V • Aufnahme von 4 Bildern • Cy3-Emission vor dem Bleichen • Auftreten des FRET • Wenig Donor Fluoreszenz • Cy5-Emission vor dem Bleichen • Zur Überprüfung, ob Kolokalisierung mit Cy3 stattgefunden hat • Cy3-Emission nach dem Bleichen • Kein FRET mehr • Donor Fluoreszenz ist stärker (Pfeile) • Cy5-Emission nach dem Bleichen • Keine Emission wegen vollständiger Ausbleichung • Datenanalyse • Nach Hintergrund-Korrektur mittels Aufnahme von unmarkierten Zellen:Berechnung eines Transfer-Effizienz-Bildes • a= Scaling Factor für die Umrechnung der Pixelwerte in Effizienzwerte

  15. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy VI • Auswertung • Im Beispiel Effizienz-Werte zwischen 0 und 40% • lassen hier nicht auf spezifische WW zwischen den Nucleotidasen schliessen • Effizienz hängt ab von der Oberflächendichte der Proteine in der Membran (Zufällige Nähe) • Fazit • Transfer Effizienz reflektiert nicht unbedingt eine spezifische WW • E abhängig von vielen Parametern: • Größe des gelabelten Proteins • Sättigung des Antigens mit Antikörper • Orientierung der Fluorophore • Durch systematische Veränderung von experimentellen Parametern können spezifische WW unterschieden werden • Verhältnis von Donor- zu Akzeptor-Markierung • Gesamtkonzentration von markierten Molekülen

  16. NMR chemical shift mapping I • Zielsetzung • Bestimmung von Wechselwirkungen und Interaktionsstellen zwischen Proteinen mittels zweidimensionaler (1H, 15N)-HSQC-NMR-Spektroskopie • Grundlagen der H-NMR Spektroskopie • Im Magnetfeld: Parallele Ausrichtung von Protonenkernen • Erhöhung der Feldstärke => Umorientierung der Kerne, antiparallel zum Magnetfeld • Hierbei Resonanzphänomen: Absorption von Energie=> NMR-Signal • Identifizierung aller Protonen in einem Moleküloder ein Komplex aus Molekülen

  17. NMR chemical shift mapping II • Die chemische Verschiebung • Abschirmung • Elektronen um den Kern erzeugen Magnetfeld, entgegengesetzt zum äußern Magnetfeld => Abschirmungseffekt • Höhere Magnetfeldstärke benötigt um Abschirmung zu umgehen • Signal im niedrigeren Frequenzbereich => diamagnetisch • Entschirmung • z.B. durch elektronegative Bindungspartner (Halogene, O, N)diese ziehen die Elektronen zu sich • Niedrigere Feldstärke benötigt • Signal im höheren Frequenzbereich => paramagnetisch • Signalverschiebung relativ zu Referenzsignal TMS (Tetramethylsilan) • Alle Protonen in TMS gleiche chem. Umgebung=> nur ein Signal • Alle Protonen maximal abgeschirmt

  18. NMR chemical shift mapping III • Die J-Kopplung • Spin-Spin Kopplung • Benachbarte Protonen beeinflussen sich gegenseitig bzgl. lokaler Magnetfeldstärke • Je nach Spinrichtung eines benachbarten Protons, ↑ oder ↓=> Schwächung oder Verstärkung des äußeren Magnetfelds • Da beide Zustände gleichwahrscheinlich=> Aufspaltung des Signals in Multipletts • 1 benachbartes Proton => 2 Signale2 benachbarte Protonen => 3 Signale mit unterschiedlichen Intensitätenusw. • Kopplungskonstante J • Abstand zwischen gekoppelten Signalen in Hz: Kopplungskonstante J • Je nach Wert: Abschätzungwie viele Bindungenvoneinander entfernt • 2 Bindungen, geminal, 2J • 3 Bindungen, vicinal, 3J

  19. NMR chemical shift mapping IV • (1H, 15N)-HSQC-NMR-Spektroskopie • HSQC = Heteronuclear single quantum coherence • 2D-NMR • x-Achse: Verschiebung von H • y-Achse: Verschiebung von N • Heteronuclear Single quantum: • Bestimmung der 1J Kopplung zwischen H und N=> direkt verbundene Atome • Kreuzpunkte: Kopplung von H und N • Untersuchung von Proteinen • Jede Aminosäure außer Prolin:Kopplungssignal der Amidgruppe • Ebenso AS-Ketten wegen Peptidbindung • WW zwischen Proteinen • Bindung von Ligand an 15N markiertes Protein=> Änderung der chem. Verschiebungen • Möglichkeit der Identifizierung der ww. AS beizugewiesenem Spektrum

  20. NMR chemical shift mapping VI • Experiment • Bacterial phosphoenolpyruvate sugar transport system (PTS) • Teilreaktion: • Übertragung von Phosphor • Bekannt: Spezifisch für verschiedene Spezies • Betrachtung von B. subtilis und E. coli • große Ähnlichkeit in 3D Struktur • Homologe WW stark: bsHPR + bsEIIAglc ecHPR + ecEIIAglc • Heterologe WW stark: ecHPR + bsEIIAglc schwach: bsHPR + ecEIIAglc • Fragestellung: • Kann „NMR chemical shift mapping“Spezifität der Reaktionenwiderspiegeln?

  21. NMR chemical shift mapping VII • Versuchsdurchführung • Untersuchung von nicht phosphorylierten Proteinen um • Mögliche Rückreaktion auszuschließen • Phosphohydrolysis auszuschließen • Phosphorylierung hat keinerelevanten Auswirkungen auf WW • 4 NMR-Experimente • NMR-Spektren von 15N-HPR vor (blau) und nach Zugabe (rot) von unmarkiertem EIIAglc • A: ecHPR + ecEIIAglc • B: bsHPR + bsEIIAglc • C: ecHPR + bsEIIAglc • D: bsHPR + ecEIIAglc

  22. NMR chemical shift mapping VIII • Auswertung • Keine Verschiebungbei bsHPR + ecEIIAglc (D)=> Überlagerung der Kreuzpunkte=> keine WW • Durch Zuordnung der Spektren=> Identifizierung von ähnlichen Bindungstellen (schwarz) • Fazit • Methode geeignet um spezifische WW zu detektieren • Trotz hoher Konzentrationen (>200 μm) von gereinigtem Protein beiNMR-Experimenten, keine Verunreinigung der Spektren durch unspezifische WW

  23. Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm I • Idee • Protein-Protein Docking Problem • Gegeben 3D Struktur von komplexbildenden Proteinen A u. B • Ermittle 3D-Struktur des Komplexes AB • Abwandlung: zusätzlich unzugewiesenes experimentelles 1D 1H-NMR-Spektrum als Input • Verwendung des Rigid Body Docking Algortihmus von Lenhof (1995,1997) • Generiert Liste möglicher Komplexe • Bewertung mittels geometrisch energetischer Scoring-Funktion • Ziel • Bewertung der Komplexe mittels Neuer Scoring-Funktion, die Daten des experimentellen H-NMR-Spektrums miteinbezieht

  24. Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm II • Neue Scoring Funktion • Berechnet theoretisches H-NMR-Spektrum für jeden möglichen Komplex • Abweichung des simulierten Spektrums vom experimentellen Spektrum=> Bewertung der Komplexe • Berechnung der Chemischen Verschiebung des Komplexes • Zerlegt Chemische Verschiebung δ in 4 Teile: • δRC: Random Coil shift • δA: Magnetic Anisotropy • δJB: Ring current, Ringstromeffekt • δEF: Electric field effect

  25. Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm III • δJB - Electric field effect • Einfache chemische Verschiebung aufgrund von umgebenden Elektronen • Spezifisch für jede Bindung, C-H, N-H • Konstante ε übernommen von Williamson und Asakura(1993) • Elektrisches Feld berechnet mittels Gesetz von Coulomb • Atomladungen aus dem AMBER 94 Kraftfeld(Connell et al. 1995) • δRC – Random coil shifts • Verschiebungen vonnicht definiert gefaltetenAs-Ketten • Übernommen ausder BRMB Datenbank

  26. Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IV • δA – Magnetische Anisotropie der Peptidbindung • Anisotropieeffekt: Doppelbindungen C=O hat nicht in alle Richtungen die gleiche Elektronenverteilung • Oberhalb der Bindungsebene stärker abgeschirmt als in der Ebene • Modelliert nach McConnell (1957) mittels Suszeptibilitäts-Tensor (Matrix) • Kennzeichnet Orientierung eines Protons zur anisotropen Bindung • R: Abstand Proton-Anistropische Bindung • Na: Avogadrosche Zahl • θi: Winkel zwischen i-Achse und Distanz-Vektor R • Χi: Suszeptibilitätstensor für Carbonylgruppe der Peptidbindung

  27. Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm V • δJB – Ringstromeffekt • Ebenfalls Anisotropieeffekt: Aromatische Ringsysteme verursachen ungleiche Elektronenverteilung durch π-Elektronen-System • Oberhalb der Ringebene stärkerabgeschirmt als in der Ebene • Äußeres Magnetfeld erzeugtRingstrom im Aromaten • Erzeugt seinerseits entgegengesetztes Magnetfeld • Modelliert nach Johnson and Bovey (1958): • n = Anzahl der π-Elektronen • e0, m = elektrische Ladung und Masse • e = Lichtgeschwindigkeit • a = Ring Radius (5-Ring 1,182Å ; 6-Ring 1,39Å) • p, z = geben die Position des Kerns relativ zum Ring-Zentrum wieder • K,E = komplett elliptische Integrale

  28. Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VI • Bestimmung eines theoretischen NMR-Spektrums • Simulation mittels Lorentzschen Linien • Gesamtspektrum = Linearkombination derLorentzlinien • W = Linienbreite( 0.0032 ppm2 ) • Pi = Peakposition • Entfernung der Peaks für austauschbare Protonen (OH, NH), nicht in wässriger Lösung vorhanden • Bestimmung der Differenz zwischen experimentellem (Sexp) und simuliertem Spektrum (Sepx) an 5000 verteilten Positionen xi im Bereich (-2 bis +12 ppm) • Normalisierte Werte werden zum Bewerten der Strukturen verwendet

  29. Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VII • Ziele der Integration von NMR-Daten in RBD-Algorithmen • Erhöhung der Zuverlässigkeit der RBD-Algorithmen durch neueScoring-Funktion • Beschleunigung der Strukturaufklärung durch simulierte Verschiebungszuweisungen basierend auf Docking-Resultaten • Evaluierung • 4 Komplexe • Calmodulin + Ca2+abhängige Proteinkinase • Calmodulin + Bindungspeptid der Ca2+ Pumpe • S100B(ββ) + Peptid aus P53 Protein • Homodimere Untereinheiten von S100B(ββ) • Einzelstrukturen aus PDB • Generierung der exp. NMR-Spektren aus Shiftzuweisungen der BRMB-Datenbank

  30. Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VIII • Auswertung • Auftragung dermöglichen Komplexe • x-Achse: RMSDy-Achse: Atom-KontaktEnergie • Beste Ergebnisse linkeuntere Ecke • Beste Ergebnisse ohneAnisotropieshift=> herausgenommen,lokaler Effekt S100 dimer Cal + Pump S100 + p53 Cal + Kinase

  31. Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IX • Auswertung • Calmodulin + Ca2+abhängige Proteinkinase • Sehr gutes Ergebnis • Calmodulin + Bindungspeptid der Ca2+ Pumpe • Gutes Ergebnis • Allerdings falsche Struktur auf Platz 1Grund unbekannt • S100B(ββ) + Peptid aus P53 Protein • Gutes Ergebnis • verwunderlich, da mit herkömmlichen Scoring-Funktion nicht zu docken • Untereinheiten von S100B(ββ) • Gute Trennung zwischen zwischen True und False Positives • Fazit • Evaluation mit mehr Strukturen benötigt • Weiterer Schritt Voraussage von Komplexstrukturen ohne NMR-Spektrum • Geplant: Integration von mehrdimensionalen NMR-Spektren, welche mehr strukturelle Informationen enthalten S100 + p53

  32. Fazit • Experimentelle Methoden oft sehr spezifisch • dienen zur Verifikation von theoretischen Erkenntnissen • unabdingbar bei der Evaluation von bioinformatischen Methoden • Nachteile: • Erfordern hohes Fachwissen • Fehleranfällig • Stark abhängig von experimentellen Bedingungen • Zeit- und Kostenintensiv • Ausblick: • Kombination von experimentellen Daten und bioinformatischen Methoden bringt Vorteil

  33. Referenzen • Phizicky, E.M. and Fields, S., (1995) Microbiol. Rev., 59, 94-123. • Protein-Protein Interactions: Methods for Detection and Analysis. • Kenworthy, A.K., (2001) Methods, 24, 289-296. • Imaging Protein-Protein Interactions Using Fluorescence Resonance Energy Transfer Microscopy. • Rajagopal, P., Waygood, E.B., Reizer, J., Saier-Jr., M.H., and Klevit, R.E., (1997) Protein Science, 6, 2624-2627. • Demonstration of Protein-Protein Interaction Specificity by NMR Chemical Shift Mapping. • Kohlbacher, O., Burchardt, A., Moll, A., Hildebrandt, A., Bayer, P., and Lenhof, H.-P., (2001) J. Biol. NMR, 20, 15-21. • Structure Prediction of Protein Complexes by a NMR-based Protein Docking Algorithm.

  34. Ende • Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit • Fragen, Fragen, Fragen ? ? ?

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