Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn Molekulare Biotechnologie Ruprecht-Karls-Unive

1. Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn Molekulare Biotechnologie Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

2. Gliederung • Begriff und Geschichte der PCR • Ablauf der PCR allgemein • Mathematische Beschreibung der PCR • mathematische Problemstellungen der PCR • Quantitative PCR • RT-PCR • Real Time PCR • Beispiele Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

3. I. Begriff und Geschichte • PCR (Polymerase Chain Reaction) • „Polymerase-Kettenreaktion“ zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren • Erfinder: Kary Mullis (1985) • PCR eröffnet in fast allen Bereichen der Naturwissenschaft zahlreiche neue Möglichkeiten • Nobelpreis für Mullis 1993 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

4. II. Ablauf der PCR allgemein I • Benötigte Reagenzien (Master Mix) • Nukleotide (dNTP): dATP, dGTP, dTTP, dCTP • Taq DNA-Polymerase: Enzym repliziert DNA • Enzym-Cofaktor: Mg2+ • Enzym, welches Kontaminationen abbaut • Puffer: Erhaltung pH-Wert, Salzkonzentration • spezifische Primer (20-30 Basen: sense-, antisense) • zu amplifizierende DNA Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

5. II. Ablauf der PCR allgemein II • PCR ist 3-Schritt-Prozess (Zyklus) • 1. Denaturierung (T>90°C): ein dsDNA Molekül in zwei ssDNA Moleküle • 2. Annealing (Anlagerung: 40°C<T<65°C): Bindung spezifischer Primer an Zielsequenz • 3. Extension (Verlängerung: T≈72°C): Synthese (5‘-3‘) zwei ssDNA zu zwei dsDNA Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

6. zu vermehrender DNA-Abschnitt 3’ 5’ 3’ 5’ Denaturierung(T>90°C) 3’ 5’ 3’ 5’ Annealing (40 – 65 °C) 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ DNA-Synthese (72 °C) 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’

7. PCR-Gerät Schutzhaube Heizblöcke Steuerungseinheit

8. III. Mathematische Beschreibung der PCR I N 0 Zyklus 1 Zyklus 2 Zyklus 3 Zyklus 4 1 Denaturierung 2 Annealing 3 Extension N = N0 * 2n N N N = Zahl der amplifizierten Moleküle N0 = Zahl der Startmoleküle n = Zahl der Zyklen N n 0

9. N 0 III. Mathematische Beschreibung der PCR II theoretisch: 20 Zyklen: 1,048,576 30 Zyklen: 1,073,741,824 N N N n 0 • Plateau-Phase • Limitierung von Reaktionskomponenten • Thermische Inaktivierung der DNA Polymerase • Reassoziation der PCR-Produkte konkurriert mit Primeranlagerung Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

10. III. Mathematische Beschreibung der PCR III • Effizienz E der PCR: • Anteil der Matrizen (Templates), die in jedem Schritt umgesetzt wird ≠ 100% • E meist um die 85% • geringe Veränderungen E  große Veränderungen N • Beispiel: • E=0.85; n=30 => N=10.4*107N0 • E=0.80; n=30 => N= 4.6*107N0 N = N0 * (1+E)n E = Amplifikationseffizienz Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

11. IV. Mathematische Problemstellungen I • Primer Schmelztemperatur • Einfaches Modell Primer kürzer als 14 Nukleotide: TM=2*(A+T)+4*(G+C) Primer länger als 14 Nukleotide: TM=64.9+(G+C-16.4)/(A+T+C+G) • entscheidend ist der GC Gehalt (3 H-Bindungen), beeinflusst TM maßgeblich Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

12. IV. Mathematische Problemstellungen II • Kompliziertes Modell • R… molare Gaskonstante R=1.987(cal/°C*mol) • g… dimensionslose molare Primerkonzentration g=50*10-9 • T0=-273.15°C • t… Temperaturkurrektor t=-21,6°C • DS… Entropie des Primers in cal/(K*mol) • DH… Enthalpie des Primers in kcal/mol Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

13. IV. Mathematische Problemstellungen III • Berechnung Enthalpie, Entropie: DH(p)=i=1Sn-1DH(pi,pi+1); DS äquivalent Beispiel: p=GGAT DH(GGAT)=DH(GG) +DH(GA)+DH(AT) Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

14. V. Quantitative PCR I Frage: Wie groß ist N0? • Methode 1: Titrationsanalyse • Verwendung externen Standards mit bekanntem N0 • Anfertigung Verdünnungsreihe von Standard und Probe • Amplifikation in n Zyklen Berechnung N0 Probe über Steigung Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

15. V. Quantitative PCR II • Auswertung: • der Unterschied von N0 ist proportional zu den Steigungen der Geraden • man sucht Wert auf x-Achse (linearer Teil) • Abtragung der dazu gehörigen y-Werte • Differenz dieser Werte gleich der Differenz von N0 von Probe und Standard • so etwa 2- bis 10-fache Konzentrationsunterschiede bestimmbar Probe Standard Log N Log N0 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

16. V. Quantitative PCR III • einfaches Beispiel: • N0S=100 (log N0S=2), n=20, E=0.85 => NS=100*(1+0.85)20 • NS=2.21*107 => log NS=7.344 • NP bei N0=100 => log NP=7.568 • log N0S + 0.224 ergibt log N0P • log N0P=2.224 • N0P=168 Probe Log N Standard 7.568 7.344 2 Log N0 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

17. Log N 0 V. Quantitative PCR III • Methode 2: lineare Analyse N = N0 * (1+E)n Log N = [Log (1+E)]*n + Log N0 (nach: Y = a * X + b) Log (1+E) Log N 0 n Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

18. Mangan-Ionen VI. Reverse Transcriptase oder RT-PCR Ausgangsmaterial: m-RNA ds-cDNA Enzym: Reverse Transcriptase Retroviren Tth-Polymerase Reverse Transcriptase Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

19. 5’ 3’ mRNA 3’ 5’ Primer 1 Reverse Transkription einzelsträngige 3’ 5’ cDNA 5’ 3’ Primer 2 doppelsträngige 5’ 3’ 3’ 5’ cDNA Amplifikation Primer 1 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Primer 2 Synthese des komplementären cDNA Stranges

20. In diesem Zustand Detektion möglich Echtzeitmessung mit jedem Zyklus VII. Real Time PCR Im Prinzip wie eine Standard PCR, jedoch mit Farbstoff der in die DNA interkaliert früher: Ethidiumbromid und Detektion mit Videokamera heute: Fluoreszierende Farbstoffe und digitale Aufnahme Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

21. Fluoreszenz Zyklenzahl Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

22. VIII. Messung von Metallothionein-I mRNA Auswertung Auftragen der Werte in ein Diagramm: x-Achse = log(Std.DNA) y-Achse = log(Verhältnis) Geradengleichung: Schnittpunkt mit der x-Achse ist Äquivalenzpunkt (log1=0) Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

23. VIII. Gen-Expression durch RT-PCR CT-Wert • Patientenabhängig • Errechnet sich aus den Zyklen, die benötigt werden, um einen spezifischen Schwellenwert zu überschreiten ( Fluoreszenz) • Normierung des CT-Wertes des Target-Gens • Eichung des CT(Target)-Wertes zu Bezugsexpressionsgröße 2 -∆∆CT relative Expression in Bezug auf Calibrator-Gen (100%) Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn

24. Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn