分析系応用実習
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分析系応用実習. 環境汚染物質の分析. 061130. 考える習慣を身につけよう. 実習の内容. 1) 実習講義・器具点検・試薬調製 2) ①室内環境:ホルムアルデヒドの測定 ②水質試験法:溶存酸素 (DO) の測定 3) ①農薬を GC で検出・定量 ②室内環境:気温、気湿、カタ冷却力、気動、感覚温度 を算出、騒音、照度、炭酸ガスの測定 4) 重金属の原子吸光光度法による検出・定量 5) アオコの毒素 microcystin の HPLC による検出・定量 6) 今回の実験のまとめ・報告会、器具点検.

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Presentation Transcript

分析系応用実習

環境汚染物質の分析

061130



実習の内容

1) 実習講義・器具点検・試薬調製

2) ①室内環境:ホルムアルデヒドの測定

②水質試験法:溶存酸素 (DO)の測定

3) ①農薬をGCで検出・定量

②室内環境:気温、気湿、カタ冷却力、気動、感覚温度 を算出、騒音、照度、炭酸ガスの測定

4) 重金属の原子吸光光度法による検出・定量

5) アオコの毒素microcystinのHPLC による検出・定量

6) 今回の実験のまとめ・報告会、器具点検


HPLC使用の実習(アルデヒド)のおさらい

実習書p19参照

①は、ホルムアルデヒド

②は、アセトアルデヒドでした

では・・・

矢印で示されたピークって何?

考え方・・・

検出される化合物の共通点?

検出波長?

疎水性の大きさ?


Microcystis aeruginosa

アオコの異常発生

2005/8/2 長野県諏訪湖


アオコ発生

geosmin

湖沼生態系の循環図

湖沼

富栄養化

生合成

N, P

2-methylisoborneol

毒性発現

肝臓毒

カビ臭物質

肝臓毒性

発がんプロモーター作用

人類

(Microcystin類)


Microcystin
Microcystin 類の構造

6. D-Glu (iso)

実習書p45 参照

7. Mdha

1. D-Ala

5. Adda

3. D-b-Me-Asp (iso)

Adda: (2S,3S,8S,9S)-3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4(E),6(E)-dienoic acid

D-β-Me-Asp: D-erythro-β-methylasparatic acid

Mdha: N-methyldehydroalanine


Microcystin1

疎水性

親水性

Microcystin 類の物理化学的性質

・Adda 部は疎水性、他の部位は親水性を示す

・有機溶媒と水系溶媒の両溶媒に溶けにくい

・光により幾何異性化や分解が起こり、毒性が軽減、消失する

・熱に安定。


Microcystinの生理活性

・肝臓に特異的に蓄積

・タンパク質脱リン酸化酵素 (PP) 1

 およびPP2Aの阻害

・肝臓細胞のアポトーシス誘導

・肝臓の出血

・発がんプロモーター作用

Microcystin-LRによるPP1の活性阻害

J. Goldberg et al. Nature, 376, 745 (1995)


経口投与

LD50 10~15 mg/kg

腹腔内投与

LD50 75 mg/kg

皮下投与 LD50 75 mg/kg

気管内投与

LD50 75 mg/kg

Microcystin-LRの生理活性

Microcystinの70種近い同族体のうち、Microcystin-LRの毒性が一番強い。

経口よりも、直接血液等に入る場合に、毒性が発現しやすい。

毒性は、フグ毒テトロドトキシンと同程度、青酸カリの数十倍程度。


Microcystin lr yr rr
Microcystin-LR, YR, RR の比較

疎水性の違いはどこからくるか?実習書p45参照

R1

R2

L-Leu

L-Tyr

L-Arg

L-Arg

microcystin-RR

microcystin-YR

microcystin-LR


Microcystin ods

  :疎水結合

Microcystin類のODS シリカゲルカラム内の挙動

Time

移動相

MCLR

MCLR

ODS

MCYR

ODS

MCLR

ODS

ODS

MCYR

MCRR

保持

MCLR

MCRR

MCYR

溶出

溶出

溶出

microcystin(MC)の 疎水性: MCRR< MCYR< MCLR


Microcystin2

Microcystin-LRのUVスペクトル

吸光度

波長 (nm)

Microcystin 類の検出

Adda

共役ジエン

238 nm

Microcystin 類は 238 nm 付近に吸収極大をもつ。この吸収極大はAdda の構造中の共役ジエン(S-trans ジエン)に由来している。

217 nm+15 nm+ 8 nm = 240 nm

ジエン

移動相の40 %

メタノール

ジエンに結合する

3つのアルキル基


MCLR

MCYR

MCRR

HPLC 装置

インジェクター

ポンプ

カラム

圧力計

移動相

HPLC 条件

移動相:メタノール:0.05 Mリン酸緩衝液 (pH 3.0)=6:4

検出器

カラム: STRODS-2(Shimadzu)      (4.6×150 mm)

記録装置

流速:1 mL/min

廃液

注入量:20 mL

検出:UV 238 nm

最新機器分析学 南山堂


Hplc microcystin lr rr yr
HPLC による microcystin-LR, RR, YR の分離

(保持時間)

溶出順と疎水性の関係は?

疎水性:microcystin-RR microcystin-YR microcystin-LR

分析系応用実習テキスト p.46


Microcystin3

抽出

クリーンナップ

HPLC

ラン藻に含まれる microcystin の定量

本日配布資料参照

・諏訪湖産ラン藻Suwako97

 およびSuwako99

乾燥藻体

(重量を記録)

抽出液

試験溶液

検量線と照らし合わせ濃度を算出→このあと?

今回、検量線作成のためのクロマトグラムは、実際に標準サンプルをHPLCに入れて、各班で作成します。


抽出

20mLのシリンジ

乾燥藻体

上清液

5 % 酢酸15mL

遠心分離

ガラス繊維

フィルター

1300 × g

(約 3000 rpm)

10分

遠心管を使用(撹拌子を入れるのを忘れずに)

上清液

撹拌

抽出ろ液

(30分)

絶対に遠心管を振らない!

・有機溶媒(アルコール等)を用いて抽出すると・・・? なぜ酢酸で抽出してるの?

分析系応用実習テキスト p.44


10mL

② クリーンナップ(固相抽出)

あらかじめ ODS カートリッジには、メタノール→水(各5mLずつ)を

流しODS 基を活性化させておく、また操作中ODSカートリッジは、

乾燥させないよう、前の溶液をほんの少し残し、次の溶液を入れる

抽出ろ液

活性化に用いた廃液:マイヤー①

○抽出ろ液をODS カートリッジに通す

空気

○水(5mL)

水画分廃液:マイヤー②

ジョイント

○20 % メタノール(5mL)

20%メタノール画分廃液:マイヤー③

各溶液

○90 % メタノール(5mL)

試験溶液用すり付きナス型フラスコ(microcystin画分)

○メタノール(5mL)

ODS カートリッジ

溶出液(90%、100%メタノール画分のみ)

濃縮乾固(ロータリーエバポレーター)

40 % メタノール(10mL)に再溶解

適宜希釈、ろ過(メンブレンフィルター)

溶出液

(マイヤー①~③、ナスコル)

試験溶液とし、HPLC 分析

分析系応用実習テキスト p.44


濃度算出-検量線法-

ピーク面積

microcystin 標準溶液

:0.4 mg/mL

検量線

:2.0 mg/mL

(なぜ直線・・・?)

:試験溶液

0

0.4

2.0

microcystin 濃度(mg/mL)


脂溶性が高い物質(色素等)を抽出しにくい。脂溶性が高い物質(色素等)を抽出しにくい。

⇨クリーンナップの操作が容易になる。

⇨HPLC による定量が正確に行える。

疎水性の低い物質(不純物)を除去。

⇨ピークの明確化により、HPLC による定量を正確に行える。

microcystin は種類により疎水性が異なる。

⇨ODS シリカゲルカラムを使った HPLC を用いて分離、定量ができる。

まとめ

乾燥藻体

抽出

(5% 酢酸)

抽出液

クリーンナップ

(ODS カートリッジ)

試験溶液

HPLC

検量線と照らし合わせ濃度を算出


実験スケジュール脂溶性が高い物質(色素等)を抽出しにくい。

撹拌抽出(30分間)

HPLC分析:標準溶液の分析

 (各班1台割り当て)

質問があれば、待ち時間にODSカートリッジ

使用方法説明

遠心分離(10分間)

固相抽出(ODSカートリッジ)クリーンナップ

エバポレーター → 再溶解 → メンブレンフィルター

HPLC分析:抽出試料の分析


・遠心沈澱管・ナス型フラスコ立て 脂溶性が高い物質(色素等)を抽出しにくい。4コ

 (特に汚れていなければそのまま返却)

・遠心沈澱管 50 mL 2コ

・撹拌子 2コ

・テルモシリンジ 10 mL(ODSカートリッジ加圧用) 2コ

・ODSカートリッジ用ジョイント(絶対に捨てないで)2コ

・ナス型フラスコ 50 mL(すりのふた付き) 2コ

・ガラスシリンジ 2 mL(メンブレンフィルター用) 2コ

・ガラスシリンジ用針    2コ

・メスフラスコ 10 mL2コ

・白蓋付きバイアル 2ml    2コ

 (以上9点は洗浄して返却)

渡すもの(要返却)


・凍結乾燥した諏訪湖産ラン藻(脂溶性が高い物質(色素等)を抽出しにくい。Suwako97) 約100 mg

・凍結乾燥した諏訪湖産ラン藻(Suwako99)約100 mg

 (以上2点はキムワイプ・ろ紙等に吸わせてアオコ用ゴミ箱に廃 

 棄:試薬台4)

・テルモシリンジ 20 mL(ガラス繊維フィルター用) 2コ

・ガラス繊維フィルター 2コ

・ODSカートリッジ 2コ

・メンブレンフィルター 2コ

 (以上4点は医療用プラスチックとして廃棄:入り口横)

渡すもの(廃棄)


使う溶液(ドラフト脂溶性が高い物質(色素等)を抽出しにくい。) 標準品(HPLC前)

・5%酢酸 ・MCRR, YR, LR混合溶液

・メタノール (2 mg/mL, 0.4 mg/mL)

調製する溶液

・20%メタノール

・90%メタノール

・40%メタノール

使う機器

・マグネチックスターラー :12本同時(試薬台4)

・遠心沈殿管用天秤 :2本同時(試薬台4 )

・遠心分離機 :4本用+8本用(試薬台4 )

・エバポレーター :4つ同時(試薬台5)

・HPLC :各班(実習室南側窓際)

溶液および機器


Microcystin 脂溶性が高い物質(色素等)を抽出しにくい。含有廃液

(準備室前)

Microcystin 含有溶液

(ナスコル・メスフラスコ・小バイアルのみ)

廃液

有機溶媒廃液びん

(ドラフト南端)

Microcystin を含まない

有機溶媒含有溶液(マイヤー①③)

Microcystin ・有機溶媒

を含まない水溶液(マイヤー②)

流し(各実験台)


日時:脂溶性が高い物質(色素等)を抽出しにくい。10月 22日(木) 13:10~

場所:6号館4階 情報メディア教室

発表会について

10月 21日(水) 実習時間内に各班の担当項目を決定(各班2項目)

発表担当者は当日指名(各班のaから1人、bから1人)

発表方法:発表担当者は準備したスライド等を使用して発表を行う。

発表内容:実習テキスト(p.ⅲ)を参照。

発表時間:各項目10分程度、質問を含めて15分以内。

発表を担当しない班は3回以上質問をすること。


レポート提出:脂溶性が高い物質(色素等)を抽出しにくい。10月28日(水)18:006号館1階薬学教育開発センター

レポート返却:11月 4日(水)12:20~18:00 上記同じ場所

レポート・実習試験について

実習試験:11月7日(土) 15:00~ 61(AB)、62(CD)教室

レポートの内容

・目的

・実験の流れ(フローシートで)

・検出のための原理

・考察

一項目一枚に収めてください。

それぞれの実験の操作の意味や原理をしっかり考えて書いてください。


スライドショーの最後ですが、クリックしても終了しませんスライドショーの最後ですが、クリックしても終了しません


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