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CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI Sara Caldarola Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni)

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CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI Sara Caldarola Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni) [email protected] ORARIO di RICEVIMENTO: Mercoledi 11:00-12:00. ANIMALI TRANSGENICI : definizione.

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Presentation Transcript
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CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI

Sara Caldarola

Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni)

[email protected]

ORARIO di RICEVIMENTO:

Mercoledi 11:00-12:00

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ANIMALI TRANSGENICI :

definizione

Animali transgenici: animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso di specie diverse.

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ANIMALI TRANSGENICI :

come si producono???

Vettori retrovirali

Microiniezione del DNA

Cellule staminali embrionali

Gene targeting/ gene trap

KO condizionali

Trasferimento del nucleo

GFP

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VETTORI RETROVIRALI

  • Permettono il trasferimento e l’integrazione
  • di materiale genetico nella cellula ospite
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Vantaggi dei vettori non virali

  • Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni
  • Riduzione del rischio di reazione immunitaria
  • Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi
  • Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo

Svantaggi dei vettori non virali

  • Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione
  • Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale

Vantaggi dei vettori virali

  • Alta efficienza di trasduzione

Svantaggi dei vettori virali

  • Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite
  • Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma)
  • Molecole di DNA di dimensioni limitate
  • Reazioni immunitarie
  • Costi elevati
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Ciclo vitale di un retrovirus

• genoma a RNA, 2 copie

• L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in DNA a doppio filamento nel

citoplasma della cellula infetta.

• Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato è chiamato provirus.

• L’apparato della cellula ospite trascrive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni.

• 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione

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Genoma retrovirale

Trascrittasi inversa e integrasi

Proteina strutturale capside

Proteina per involucro

Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside

Lunga sequenza terminale ripetuta

Vettore retrovirale

Inserito nelle

cellule eucariotiche

con bassissima efficienza

tramite

trasfezione/elettroporazione

Con alta efficienza

Mediante

INFEZIONE

Lunghezza massima: 8Kb

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Le particelle virali prodotte sono difettive per la replicazione

  • Possiedono un gene marcatore selezionabile (NeoR)
  • Infettano facilmente cellule in attiva replicazione
  • Si integrano stabilmente nel genoma ospite e producono il geneX

INFEZIONE DI CELLULE IN COLTURA

E PRODUZIONE GENE X

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Packaging cell lines

Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni.

La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del costrutto nel virione.

Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.

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Utilizzo vettori retrovirali:

TERAPIA GENICA

Tecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule somatiche di un paziente

Scopo:

• Correggere un difetto genetico

• Fornire una nuova funzione alla cellula

Applicabilità:

1. Malattie genetiche classiche

(un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana)

2. Malattie multigeniche (cancro)

3. Malattie genetiche acquisite (AIDS)

4. Malattie non genetiche

80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4

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Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA

• Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato).

• Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina

terapeutica (a livelli adeguati).

• Capace di incorporare DNA di varie dimensioni.

• Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o

post-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico

• Non dovrebbe essere patogeno.

• Amministrabile direttamente nel paziente.

• In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio.

• Ben tollerato.

• Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune.

• Facile da produrre in maniera riproducibile.

IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU’ UTILIZZATO OGGI E’ IL VETTORE RETROVIRALE

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ANIMALI TRANSGENICI :

come si producono???

Vettori retrovirali

Microiniezione del DNA

Cellule staminali embrionali

Gene targeting/ gene trap

KO condizionali

Trasferimento del nucleo

YAC

GFP

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2) MICROINIEZIONE del DNA

Gli organismi transgenici possono essere ottenuti modificando cellule embrionali totipotenti mediante iniziezione di materiale genetico

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Stimolazione della ovulazione delle femmine donatrici (da 5 a 35)

Dopo accoppiamento gli ovuli fertilizzati sono

microiniettati con DNA lineare contenente

il transgene (circa 200 copie)

all’interno del pronucleo maschile

Gli ovuli microiniettati (25-40) vengono impiantati

in una madre adotttiva resa pseudogravida da maschio

vasectomizzato. Dopo 3 settimane progenie e analisi.

Accoppiamento e analisi progenie per

capire se integrazione

è nella linea somatica o germinale

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Il gene inserito viene integrato nel genoma della cellula uovo che viene trapiantata in una madre adottiva , che darà origine alla nascita di un topino “chimera” (mosaico di cellule con patrimoni genetici diversi). Nella fase successiva si effettua un incrocio riproduttivo tra il topino chimera e un topo normale con la nascita di topini con i nuovi geni ma eterozigotici; solo nell’incrocio successivo tra i precedenti avremo la nascita di topini omozigotici per il gene introdotto

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EFFICIENZA DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA

Al max 5% degli ovuli inoculati

genera prole transgenica!!!

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ANIMALI TRANSGENICI :

come si producono???

Vettori retrovirali

Microiniezione del DNA

Cellule staminali embrionali

Gene targeting/ gene trap

KO condizionali

Trasferimento del nucleo

GFP

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2) Cellule staminali embrionali (ES cells)

Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti, infatti possono dare origine a cellule di tessuti differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti(cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione

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CALCIO FOSFATO

  • Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per endocitosi) entrano nelle cellule
  • LIPOSOMI
  • Lipidi che permettono la formazione di vescicole liposomiali
  • Il DNA all’interno entra nella cellula mediante fusione vesciola-membrana

Integrazione

Sito specifica

RICOMBINAZIONE

OMOLOGA

  • ELETTROPORAZIONE
  • Scarica elettrica che altera la permeabilità della membrana generando
  • “buchi” e permettendo l’entrata di DNA esogeno

IDENTIFICAZIONE di ES CELLS con TRANSGENE

integrato nel sito corretto

SELEZIONE

POSITIVA/NEGATIVA

PCR

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SELEZIONE POSITIVA-NEGATIVA cellule ES

Seq di DNA per RICOMBINAZIONE OMOLOGA nel genoma bersaglio

TRANSGENE di interesse

Gene che conferisce resistenza alla G418

Geni della Timidina Kinasi (virus herpes simplex). In presenza di GANCICLOVIR: MORTE

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SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA

ASPECIFICA

SPECIFICA

  • Aggiunta di G418: SELEZIONE POSITIVA di cellule che hanno INTEGRATO il DNA
  • Aggiunta di GANCICLOVIR: SELEZIONE NEGATIVA di cellule con INTEGRAZIONE ASPECIFICA
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METODO della SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA

non è infallibile ma ARRICCHISCE la popolazione delle ES cells

in elementi con TRANSGENE integrato nel sito CORRETTO

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PCR

SPECIFICA

ASPECIFICA

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Il GENE TRAPPING

  • 1) Consente l’isolamento di nuovi geni
  • 2) Consente la determinazione del profilo di espressione del gene intrappolato
  • 3) È mutagenico: produce knockout

X-gal staining of E9.5d embryo showing reporter gene expression associated with a secretory trap insertion in a novel gene. Courtesy K. Pinson

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STRATEGIA DEL GENE TRAP

Scelta opportuna del vettore e del sistema di trasferimento

Selezione dei cloni tramite “marker”

Localizzazione dell’inserto nel clone selezionato

ANALISI DEL FENOTIPO

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ELEMENTI necessari per

gene trap:

  • Cellule staminali embrionali di Topo o Uomo
  • “Entrapment vector” contenente :
  • - gene reporter
  • - marker di selezione
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Cellule staminali embrionali di Topo

Integrazione

Sito specifica

SELEZIONE di ES CELLS con TRANSGENE

integrato nel sito corretto

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Geni reporter

  • The E.colilacZ gene (produzione di beta-Gal)
  • The firefly luciferase gene
  • The jelly fish green flourescence protein (GFP) gene

“Lac Z staining”: colorazione istochimica che rivela la presenza della beta-galattosidasi. Questo enzima, in presenza del substrato X-Gal, produce un prodotto insolubile di colore BLU. Questo metodo visualizza la presenza della beta-galattosidasi sia nell’organo “in toto” sia in specifici tessuti/cellule.

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Elementiimportanti

per espressionedi un gene e

utilizzati per il

GENE TRAPPING

Enhancer corte sequenze che stimolano l’attività trascrizionale

di un promotore

Promotore combinazione di elementi ai quali si lega l’RNA polimerasi

per iniziare la trascrizione di un gene

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Vettori utilizzati per il GENE TRAPPING

  • Enhancer trap Vector
  • Promoter trap V.
  • Gene trap V.
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Enhancer Trap

Vector

Promotore e pA

INDIPENDENTI

Endogenous gene X

P\'

lac Z

neo

Promotore

MINIMO

pA

pA

Exon 1

Exon 2

Exon 3

Enhancer

Vector Integration

DNA

lac Z

neo

Promotore

MINIMO

lac Z

neo

RNA

PROTEIN X

β-gal

NeoR

protein

slide37

Vector

Promoter Trap

Endogenous gene X

Promotore e pA

INDIPENDENTI

PROMOTORE

Promotore

ASSENTE

P\'

lac Z

neo

pA

pA

Vector Integration

DNA

neo

lac Z

RNA

neo

lac Z

protein

PROTEIN X

β-gal

NeoR

slide38

Gene Trap

Vector

Promotore e pA

INDIPENDENTI

Endogenous gene X

P\'

Promotore

ASSENTE

neo

lac Z

SA

pA

pA

Introne gene X

Vector Integration

neo

lac Z

SA

DNA

Spliced transcript

neo

lac Z

RNA

SA

NeoR

PROTEIN X

protein

β-gal

Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE

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RICAPITOLANDO…………..

  • Il GENE TRAPPPING consente
  • Identificazione NUOVI GENI
  • Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO)
  • ANALISI dell’ESPRESSIONE di GENI
ad