Metodi enzimatici in diagnostica clinica
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Metodi enzimatici in diagnostica clinica. Enzymatic reaction-based assays. Vantaggi -veloce -molto specifico. Metodi di - Misura in continuo (più facili e più utili) - Misura a tempo fisso. Influenze - pH - temperatura -forza ionica. Michaelis-Menten enzyme kinetics. K m.

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Presentation Transcript


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Metodi enzimatici in diagnostica clinica


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Enzymatic reaction-based assays

Vantaggi

-veloce

-molto specifico

Metodi di

- Misura in continuo (più facili e più utili)

- Misura a tempo fisso

Influenze

- pH

- temperatura

-forza ionica


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Michaelis-Menten enzyme kinetics

Km


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Spesso non è possibile un singolo enzima-reazione sequenziale

Eprim

Eind

B

C

A

X

Y

t ~ 0 [B] << KmB, vind = Vind.[B]/KmB - 1st order reaction

t > 0 k.[Eprim] = Vind

vind = Vind.[B]/(KmB + [B]) = Vind/(KmB/[B] + 1)

[B]  100.KmB - error 1%

It is necessary to use 10 to 100-fold excess of Eind over Eprim!!!


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

NAD(P)H assay - Wartburg optical test

A + NADH + H+B + NAD+

H

H

H

Tutte le deidrogenasi NAD o NADP dipendenti utilizzano queso metodo


Test ottico accoppiato

Test ottico accoppiato

A + BC + D

C (oD) +NADHE + NAD+

E’ possibile accoppiare una terza reazione


Calcolo attivit enzimatica

Calcolo attività enzimatica

  • 1 UI =1 micromole di substrato trasformato/min = c / min

    • Attività enziamtica (mUI / ml) =

DA V 1000

min e v d

DA = variazione assorbimento a 340

1000 = fattore di conversione alle mUI

V = volume totale della miscela di reazione

e = coeff. Estinzione molare di 1 mmole/ml di NADH a 340

6.22 cm2/mmole

v = volume del campione (ml)

d = cammino ottico (1cm)


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

esempi

NH4+

CO2


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

NO3-

H2 O2

SO32-


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Ethanol, Acetaldehyde

Acetate


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Ascorbate

578 nm


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Citrate

Malate

Fumarate

Oxalate, Formiate


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Succinate


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Lactate

Pyruvate

2-Oxoglutarate

L-Glutamate

L-Glutamine


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Glucose

Sucrose

Fructose


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Glycerol

Triacylglycerols

Free fatty acids

546 nm


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Cholesterol

405 nm

Bile acids

576 nm

Urea


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

AMP/ADP

ATP


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

NAD(P)H - bioluminescence

h.

(493 nm)

Metodi in luminescenza

ATP - bioluminescence

h.

(562 nm)


Diagnostica nell ischemia cardiaca

Diagnostica nell’ischemia cardiaca

Transaminasi glutamico ossalacetica (GOT)

GOT aumenta dopo 6 ore l’infarto

max a 36 ore

livelli normali 5gg


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Creatina fosfato

Fosfocreatina + ADPcreatina + ATP

  • Creatina chinasi

Aumenta dopo 3 ore dall’infartomax 24-30 h

livelli normali 3gg


Metodi enzimatici in diagnostica clinica

Lattico deidrogenasi

Aumento entro 2 ore max 60 ore

ritorno alla norma lento

Troponine cardiache:

molto specifiche per il cuore


Dosaggio del substrato

Dosaggio del substrato

  • 10 ml di NADH 20 mM (Ci) vengono messi in 2 ml di soluzione tampone (CfNADH = 100 µM)

  • 10 ml di piruvato prelevati dal liquido biologico (siero)

  • 10 ml di lattico deidrogenasi

  • Piruvato + NADH + H+ lattato + NAD+

  • Sapendo che l’e molare di NADH è 6,22 mM-1 cm-1

  • 0,1 mM di NADH avrà un assorbanza di 0,622 (Ai)

  • Nella lettura Af ottengo: 0,322

  • DA = elDCDA = 0,622 – 0,322 = 0.3

  • DC = DA/el = 0.3 / 6,22 mM-1 cm-1 x cm = 0,48 mM = 48 mM

  • Le micromoli di piruvato nei 2 ml della cuvetta saranno uguali a

  • 48 mM x 2 ml / 1000 = 0, 096 mmoli

  • [piruvato] = 0,096 / 10 ml (volume usato) = 9,6 mM (concentrazione del piruvato)


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