IN VITRO –TESTIEN KEHITYSTILANNE

1. IN VITRO –TESTIEN KEHITYSTILANNE Hanna Tähti Tampereen yliopisto Solututkimuskeskus REACH-seminaari 03.11.2005, Helsinki

2. EU -kauppa ihmisen & ympäristön turvallisuus  Toksikologinen riski TAUSTA LÄÄKKEET, KEMIKAALIT, PESTISIDIT, KOSMETIIKKA…

3. Epidemiologinen tieto Kliininen tieto (Q)SAR, Physikaalis kem. ominaisuudet IN VIVO Koe-eläimet TAUSTA LÄÄKKEET, KEMIKAALIT, PESTISIDIT, KOSMETIIKKA… EU -kauppa ihmisen & ympäristön turvallisuus  Toksikologinen riski

4. IN VITRO vaihtoehdot LÄÄKKEET, KEMIKAALIT, PESTISIDIT, KOSMETIIKKA… EU -kauppa ihmisen & ympäristön turvallisuus  Toksikologinen riski IN VIVO koe-eläimet Epidemiologinen tieto Kliininen tieto (Q)SAR, Physikaalis-kem. ominaisuudet

5. Koe-eläinten käyttö EU:ssa • Yhteensä 10 700 000 v. 2002 • Turvallisuusarviointi 1 060 000 10 % • Maatalouskemikaalit 123 000 1 % • Teollisuuden kemik. 136 000 1 % • Kosmetiikkateollisuus 2 700 0,025 %

6. Eläinten käyttö toksikologiassa 1999 3% 3rd Commission Report on the Number of Animal Used in the EU

7. In vitro-testien kehitykseen vaikuttavat tekijät • In 1986, the Council of Ministers: Direktiivi 86/609/EEC • 3-Rs: • Reduction, Refinement, Replacement • 1991 ECVAM • 2003 7th amendment of cosmetics directive 76/768/EEC • Ban on animal testing for finished products • 2009 for cosmetic ingredients • Marketing ban on cosmetics tested on animals where alternative methods exist • REACH

8. Registration, Evaluation, Authorisation of Chemicals • REACH:in on arvioitu lisäävän koe-eläinten käyttöä • Testausvaatimus perustuu painoluokkiin, eikä esim. altistumistodennäköisyyteen • 30 000 kemikaalia (tuotanto > 1tn/vuosi) tulee testata 11 vuoden kuluessa: • >1000 tn 2700 kemikaalia • 100-1000 tn 2500 kemikaalia • 10-100 tn 5000 kemikaalia • 1-10 tn 20 000 kemikaalia

9. billions of Euro, millions of animals, decades of testing REACH 30,000 kemikaalia > 1 t/vuosi Medical Research Council UK ( 2001) arvioi kustannukset ja keston, jos käytetään pelkästään eläinkokeita: • Financial cost: 9 billion € • Animals: 13 million • Timescale: for 1-100 t: 2048 for 100-1000 t: 2024 for 1000+ t: 2018

10. Eu:n arvio koe-eläinten määrästä • van der Jagt et al. (2004): Alternative approaches can redusce the use of test animals under REACH.-European Commission JCR Report. • Animals: 2,1- 3,9 milj. • Costs: 1143 – 2274 milj. € • Underestimation? • Grindon, C., Combes, R. and Balls, M.: The scientific, animal welfare and regulatory implications of the EU REACH system for chemical safety. Regulatory Rapporteur, April 2005. www.topra.org Validoitujen vaihtoehtomenetelmien tarve on lisääntynyt REACHin myötä

11. Validointi Validointi on tutkimus, jossa testi arvioidaan tieteellisesti toisistaan riippumattomien laboratorioiden toimesta seuraavien ominaisuuksien suhteen: • Luotettavuus (reliability) • Toistettavuus (repeatability) • Relevanssi (relevance) • tieteellinen pätevyys • ennustavuus Laatu (GLP, GCCP) Systemaattiset katsaukset, meta-analyysi

12. Testin kehittäminen ja validaatio Research &Development ? years EU Regulatory Acceptance 2 years OECD Regulatory Acceptance + 3 years Pre-validation 2 years Vali- dation 1 year Peer review 1 year • Euroopassa validaatiota koordinoi ECVAM (European Centre for Validation of Alternative Methods) • USA:ssa ICCVAM (Interagency Co-ordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) • Japanissa JaCVAM (Japanese Center for Validation of Alternative Methods) Validaatiotutkimuksen edellytyksiä: Laatu (GLP, GCCP) Systemaattiset katsaukset, meta-analyysi

13. Testimenetelmän validointi Test chemicals Reference data Consensus standard

14. Ohjeistoihin hyväksytyt in vitro vaihtoehtotestit • Genotoksisuustesti (Amesin testi, 1982, OECD) • Valotoksisuustesti (373 NRU) • EU, 67/548/EEC/B.41, 2000 • OECD, 432, 2002 • Ihokorroosiotesti (EpiDermTM, Rat TER, EpiSkinTM) • EU, 2000 • OECD (431), 2002 • Iholäpäisevyystesti • OECD (428), 2002 Replacements

15. Hyväksyttyjä/kehitteillä • Ihon herkistävyystesti (LLNA) • OECD (429), 2002, refinement,reduction • Lisäksi testejä • rokotteiden testaukseen • pyrogeenisuuden testaukseen • useita validoituja testejä, jotka eivät vielä ohjeistoissa Integroituja testausstrategioita, joita ei ole validoitu, useille vaikutuksille: • akuutti letaali toksisuus • iho- ja silmä-ärsytys • neurotoksisuus • karsinogeenisuus Refinement, reduction

16. IhokorroosioEpiSkin, RatTER, EpiDerm OECD 431 Testiaine annostetaan iholle Mitataan vaikutus solujen elävyyteen EpiDermTM 3-ulotteinen ihmisen ihomalli Validoitu 1988: 60 kemikaalia, 3 testilaboratoriota, 3 testiä Hyväksytty: EU 2000, OECD 2002

17. Ihoärsytys - Draize’n ihotestiä korvaava testi EPISKINosoittautunut paremmaksi malliksi kuin EPIDERM • Ei erottele hyvin ei-ärsyttäviä, ja lievästi ärsyttäviä kemikaaleja • Solutoksisuuden lisäksi arvioidaan spesifisempiä markkereita: • sytokiinien vapautuminen (IL- 1a) • geeniekspressio • Validaatio 2004-2005:

18. Silmä-ärsytys –Draizen kanin silmä-ärsytystestiä korvaavat testit • Eristetty naudan silmä in vitro (BCOP) • Eristetty kanin silmä in vitro (IRE) • Eristetty kananpojan silmä (ICE) • HET-CAM kananmunan alkio (chorion-allantois) Validaatio epäonnistui EC/HO, 1995; COLIPA, 1997) Seuraava vaihe Meta-analyysi ECVAM-ICCVAM retrospektiivinen validaatio 2006-2007

19. 3-ulotteinen malli Ihmisen solulinjojen yhdistelmäviljelmä

20. Portaittainen testausstrategia (Reduction) Existing information In vitro test 1 Non irritant Severe irritant In vitro test 2 Mild irritant Confirmatory test in vivo

21. Akuutti toksisuus (Refinement, Reduction) LD50 testi poistettu ohjeistoista v. 2002 Tilalla vähemmän koe-eläimiä vaativat testit: • FDT (420): 5, 50, 300, 2000 (5000) mg/kg, 5 rottaa/annos. Määritetään alin annos, joka aiheuttaa toksisuuden • ATC (423): 5, 50, 300, 2000 (5000) mg/kg, 3 rottaa/annos. Määritetään alin annos, joka aiheuttaa kuoleman • UDP (425): Aloitetaan parhaasta kuolettavan annoksen arviosta ja haarukoidaan LD50

22. Akuutin toksisuustestin kehitys • 1970 - luvulla: 150 eläintä/testaus • 1980 - luvulla, OECD, TG 451: 45 eläintä • 1990 - luvulla, TG:420,423,425: 12-16 eläintä 2002 - LD50 –testin poisto ohjeistoista

23. Akuutti systeeminen toksisuus in vitro • Solutoksisuus korreloi akuuttiin toksisuuteen • MEIC –projekti 1989-1999 • korrelaatio solutoksisuusannosten ja ihmisen veren letaaliannosten välillä • ECCVAM/ICCVAM validaatiotutkimus • A-Cute-Tox –projekti 2005-2010 • Tähtää uuden testisysteemin kehittämiseen akuutin toksisuuden luokitteluun • 140 referenssikemikaalia • Kerätään tietokanta (ihmis-, eläin- ja in vitro) • In silico ja in vitro –testausten kehittäminen • Kineettisten tekijöiden huomioon ottaminen

24. MEIC (multicentre evaluation of in vitro cytotoxicity) • Björn Ekwall 1989-1999 • 100 laboratoriota/200 in vitro testimenetelmää/50 kemikaalia • 3 ihmisen solulinjaa ennustivat systeemistä toksisuutta paremmin kuin eläintestit • Jatkossa haluttiin kehittää testipatteri, jonka osana olisi kineettisten tekijöiden arviointi ja eräät elintoksisuuksien määritykset (neurotoksikologia, munuais- ja maksatoksisuus)

25. ECVAM-ICCVAM Joint Validation Study of two In Vitro Basal Cytotoxicity Assays Akuutin toksisuuden ja solutoksisuuden välinen korrelaatio Registry of Cytotoxicity MEIC • 72 chemicals • human keratinocyte cells • BALB/c 3T3 fibroblasts • 3 laboratories (2 in USA, 1 in EU)

26. Acute Systemic Toxicity Integrated Project37 partners (14 states), granted 9 M€17 universities, 10 SME, 2 industry, 6 institutes Coordinator: Expertrådet, Sweden

27. Reproductive Toxicology Integrated Project (2004-2008)26 partners (9 states), granted 9 M€9 universities, 5 SME, 3 industry, 7 gov. Coordinators: Univ. Tübingen / ECVAM

28. Ihon herkistävyystesti Sens-it-iv (2006-2010) • 31 partneria • 14 M€ • iho- ja keuhkoreaktiot • in vitro strategian kehittäminen herkistymistä aiheuttavien kemikaalien tunnistamiseksi

29. Kehitteillä olevat testit • Mutageenisuuden ja karsinogeenisuuden arviointiin • mikronukleustesti, MNT (validaatio 2005) • solutransformaatio, CTA (validaatio 2005) • Hormonihäiritsijöiden arviointi osana ReProTect-projektia • prevalidaatio alkamassa • Toksikokinetiikka (2005) • fysiologiaan perustuva farmakokineettinen mallintaminen • suolen absorptiomalli • veri-aivoestemalli • metaboliamalli • Akuutti toksisuus kalalle • reduction alternative, peer review in 2005, Refinement, Reduction • eläintestin vaihtoehdon validaatio 2006-2007 • Elintoksisuuksien arviointi • neurotoksisuus • munuais- ja maksatoksisuus • Kroonisen toksisuuden arviointi • ECVAM-Workshop 2004, suunnitelma-asteella

30. REACH • 1-10 t/v n. 20 000 kemikaalia • in vitro ihoärsytys/korroosio • in vitro silmä-ärsytys/korroosio • in vitro genotoksisuus (bakteeritesti) • in vivo ihoherkistävyys (LLNA) • 10-100 t/v n. 5000 • in vitro sytogeenisuus, mutageenisuus • in vivo ihoärsytys/korroosio • in vivo silmä-ärsytys/korroosio • in vivo akuutti toksisuus • in vivo 28-vrk toistuva altistus • in vivo lisääntymistoksikologia • in vivo toksikokinetiikka • in vivo lyhytkestoinen kalatoksisuus

31. REACH • 100-1000 t/v, n. 2500 • in vivo 90-vrk toistuva annostus • in vivo teratogeenisuus, lisääntymishäiriöt • in vivo krooninen kalatoksisuus • bioakkumulaatio • > 1000t/v, n. 2700 • in vivo mutageenisuus • in vivo lisääntymistoksikologia • in vivo karsinogeenisuus • in vivo pitkäaikainen toksisuus (linnuissa)

32. 3Rs Background Name Scale of use etc. Physicochemical Properties Volatility Solubility etc. Existing toxicological data review Testaus- strategiat Yes Testing required No Data sufficient for classification Further information required QSAR Predicted metabolism Percutaneous absorption Corrosivity Sensitization In vitro testing Tier 1 No Yes Priorities for further testing Tier 2