发酵工程

1. 发酵工程 • 绪论 • 发酵微生物的来源 • 菌株选育与分子改造 • 发酵方法的类别与流程 • 发酵工程技术展望

2. 菌株选育和分子改造 目的 • 防止菌种退化 • 解决生产实际问题 • 提高生产能力 • 提高产品质量 • 开发新产品

3. 菌株选育和分子改造 方法 基因突变： 自然选育、诱变育种 基因重组： 杂交、原生质体融合、基因工程 基因的直接进化： 点突变、易错PCR等

4. 菌株选育和分子改造 一、自然选育 自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9 自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。

5. 菌株选育和分子改造 自然选育在工业生产上的意义 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。

6. 菌株选育和分子改造 自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离 挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验

7. 菌株选育和分子改造 二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 { 物理：紫外，快中子 诱变剂 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍

8. 菌株选育和分子改造 二、诱变育种 诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性 亚硝酸：0.07M Na2HPO4 亚硝基胍：1M NaOH 诱变剂量的选择 诱变剂的选择 出发菌株的选择

9. 菌株选育和分子改造 二、诱变育种 筛选的方法 • 随机筛选 从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。 • 理性化筛选 结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。

10. 菌株选育和分子改造 三、基因的直接进化(directed evolution) 在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。 • 突变 基因突变库的建立 • 筛选 基因突变库的筛选 • 基因复制与遗传 步骤：

11. 菌株选育和分子改造 菌种保藏方法： 1、传代培养法 保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4C˚冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。 2、载体法 使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。 常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。

12. 菌株选育和分子改造 3、悬液法 将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。 4、冷冻法 使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。 5、真空干燥法 冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10－20C˚范围内进行真空干燥。

13. 发酵工程 • 绪论 • 发酵微生物的来源 • 菌株选育与分子改造 • 发酵方法的类别与流程 • 发酵工程技术展望

14. 发酵方法的类别与流程 • 1、类别： 根据对氧的需要区分： 厌氧和有氧发酵 根据培养基物理性状区分： 液体和固体发酵 根据从微生物生长特性区分： 分批发酵和连续发酵

15. 2、发酵的流程 发酵方法的类别与流程 保藏菌种 碳源、氮源、无机盐等营养物质 空气 斜面活化 空气净化处理 扩大培养 种子罐 灭菌 主发酵 产物分离纯化 成品

16. 发酵方法的类别与流程 (1) 用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制 (2) 培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌 (3) 将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发 酵罐中 (4) 将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物 (5) 将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品 (6) 回收或处理发酵过程中产生的废物和废水

17. 发酵罐试验 菌种筛选 摇瓶试验

18. 2.1发酵原料的预处理 原料不同处理方法也有所差异。 1. 淀粉——利用前需变成糊精或葡萄糖 方法：酸水解（高压、耐酸）、酶水解法 2. 糖蜜——加热杀菌和用水冲稀，也可加酸处理后再补充无机盐 3. 碳氢化合物：石油脱蜡——一定馏分的石油经冷却脱蜡而获得的凝固点在-10℃的油，加入适量无机盐进行接种发酵

19. 2.2菌种斜面培养 • 菌种：已有的优良生产菌种和选育的新菌种 • 方法：一般都是由保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的斜面菌种开始，在正式使用前要先转接到新鲜斜面培养基上活化后，再用于种子扩大培养。

20. 2.3种子扩大培养 • 扩大培养的方法可以根据需要采用固体培养或液体培养两级不同方式。 • 固体种子扩大培养一般采用传统的制曲工艺，一般先用克氏瓶或匣子瓶进行扩大，再转接到曲盘扩大培养。 需氧微生物：将克氏瓶表面培养的菌种接到装有液体培养基的三角瓶中，在摇庆上振荡培养。 厌氧微生物：将有菌种的试管斜面或克氏瓶转接到三角瓶液体培养基中静置培养。

21. 2.4微生物发酵和控制 • 发酵方式可分为固体发酵和液体发酵两种。 • 固体发酵：适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较简单的产品。 • 液体深层发酵：适合于大规模工业化生产。 影响发酵的因素很多，如温度、pH、通风、搅拌、罐压力等等，必须适当地控制影响发酵的各种条件，掌握发酵的动态，并进行杂菌的检查和产物测定，使整个发酵过程顺利进行。

22. 2.5发酵产物的分离提取 • 利用菌体：离心沉淀或板框压滤法使菌体与醪液分开，也可以用喷雾干燥法直接做成粉剂。 • 酒精——发酵醪蒸馏塔蒸馏； • 抗菌素及有机酸——根据产物的不同特性，采用离子交换树脂吸附处理、脱色过滤、减压浓缩等方法提取精制。 • 获得的产物都要按照有关部门制定的国家标准进行质量检验和性能测定，符合要求后才为合格产品。

23. 2.5发酵产物的分离提取 • 又称下游加工，可分为四个阶段 • 培养液（发酵液）的预处理和固液分离； • 初步分离； • 高度纯化； • 成品加工

24. 2.5发酵产物的分离提取 初步分离 • 吸附法 • 离子交换法 • 沉淀法（盐析、有机溶剂、pH等电点、非离子型聚合物等） • 萃取法（溶剂萃取、两水相萃取、超临界流体萃取、逆胶束萃取） • 膜过滤（超滤、微滤、反渗透、纳滤）

25. 2.5发酵产物的分离提取 高度纯化 • 色谱分离（凝胶色谱、离子交换色谱、聚焦色谱、疏水色谱、亲和色谱） • 结晶（加入某些物质，溶解平衡发生改变，如调pH;将溶液冷却或将溶剂蒸发）

26. 发酵工程 • 绪论 • 发酵微生物的来源 • 菌株选育与分子改造 • 发酵方法的类别与流程 • 发酵工程技术展望

27. 《发酵工程技术展望》 • 商品化生物反应器 1.生物反应器产业的产品特点 2.发酵过程传感、计算机与控制技术 3.装备制造与设计技术的进步 4.一些重要的生物反应器产品

28. 《发酵工程技术展望》 • 商品化生物反应器 产值不大作用大：支撑技术 产品多样性：不同细胞、不同工艺、不同规模 生物过程优化与放大技术：活细胞 生物技术发展要求性能更高的生物反应器 产品型号更新换代与部件技术研究：综合技术 产品生产的标准化、规范化 ：技术难度大 高品质的售后技术支持：过程优化与放大

29. 《发酵工程技术展望》 • 商品化生物反应器 2.发酵过程传感、计算机与控制技术 • 传感器：DO、pH、排气成份分析系统 、培养液成分、细胞状态……、其他常用热工传感器、…… • 计算机控制系统：单片智能、工控机、pLC 、现场总线、 DCS …… • 执行器件：各式手动与自动阀门、特殊阀门、杯式补料系统 • 参数自动控制回路 温度自动控制；通气流量自动控制；罐压自动控制pH调节（手控或自控）；DO与转速、通气流量程序串级调节 ……

30. 《发酵工程技术展望》 • 商品化生物反应器 嵌入式单片计算机系统

31. 《发酵工程技术展望》 • 商品化生物反应器 生产车间计算机控制室

32. 《发酵工程技术展望》 • 商品化生物反应器 温度传感器、耐高温pH和溶氧（DO）传感器

33. 《发酵工程技术展望》 • 商品化生物反应器 新传感技术 ▼ 电 子 秤 ▲ 压 力 传 感 器

34. 《发酵工程技术展望》 • 商品化生物反应器 3.装备制造与设计技术的进步 • 标准化、规范化 • IS09001管理，提供合符用户要求及质量稳定的产品； • 制造过程：如材料、焊接、表面处理、零部件机加工、…、直到安装流程工艺； • 关键部件的技术进步及质量管理：如有关传感器、空气过滤器、阀件、管道及配件； • 符合GMP标准的生物反应器以及一些新技术的应用：如SIP自动灭菌、CIP自动清洗、机械密封、排气处理、取样处理等 。

35. 《发酵工程技术展望》 • 商品化生物反应器 4.一些重要的生物反应器产品进展

36. 《发酵工程技术展望》 • 商品化生物反应器 5-10升实验室台式发酵罐（嵌入式单片计算机系统）

37. 《发酵工程技术展望》 • 商品化生物反应器 带pH测控与补料控制的摇床

38. 《发酵工程技术展望》 • 商品化生物反应器 发酵中试数据处理系