真核生物基因转录水平的反式调控

1. 真核生物基因转录水平的反式调控 2005.9 本章主编 沈文飚教授

2. 与顺式调控相反，转录因子的调节作用被称为反式调控； • 真核生物基因转录水平的调控离不开转录因子与顺式作用元件及基因表达必需的其它转录因子之间的相互作用； • 转录因子有其复杂的多态性，包括磷酸化与脱磷酸化以及多种蛋白质的相互作用等的活性调节以及与反式作用元件的互作，前者并涉及到信号传导机制，最终增强或阻遏一系列靶基因的时空表达。

3. 真核生物基因转录因子活性和功能调节的示意图真核生物基因转录因子活性和功能调节的示意图

4. 转录因子的结构特点及其分类 • 典型的转录因子大都至少包含以下几个结构域 • DNA结合域（DNA binding domain，DB）； • 转录调控（调节）域（transcription regulation domain）中的转录活化域（transcription- activating domain，AD）和抑制域（repression domain）以及一个核定位信号（nuclear localization signals，NLS）； • 另外还可能有二聚体化结构域（dimerization domain）来协助转录因子之间相互结合，并以二聚体形式行使功能。

5. 单独的DB虽然能与启动子结合，但是不能转录激活；单独的DB虽然能与启动子结合，但是不能转录激活； • 不同转录因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的转录激活的功能； • 大多数的转录因子只含有一种类型的DNA结合域和二聚体化位点。

6. DNA结合域 DNA结合域由60-100个氨基酸残基组成，结合于顺式元件上，并又至少可以划分为含锌结构（zinc-containing modules）、同源异型（homeodomain，HD）、碱性-亮氨酸拉链（basic-leucine zipper，bZIP）、碱性-螺旋-环-螺旋（basic-helix/loop/helix，bH-L-H）和MYB结构域等五大类。

7. Ⅰ 含锌结构 • 至少有3类含锌结构是DNA结合域，都包含一个或数个锌原子以及与其相结合的半胱氨酸残基和组氨酸残基，使得蛋白质基序能够形成α螺旋，并与DNA大沟的形状相适应。 • 这些结构包括：1）锌指；2）类似糖皮质激素受体及其它核受体；3）类似酵母GAL4，包含有2个锌原子和6个半胱氨酸残基。

8. Ⅱ 同源异型结构域： 包含约60个氨基酸，并形成螺旋-转折-螺旋（helix-turn-helix）DNA结合域。该类型最早发现于果蝇中有发育调节作用的同源异型盒（homeobox）蛋白。已经证实HD是同源异型盒基因（homeobox gene）中高度保守的序列同源异型盒所编码。同时根据植物同源异型盒基因所编码的HD及其两侧序列的同源性以及其它保守结构序列的不同，又可分为KN1、HD-Zip、GLABRA2、PHD-Finger和BELL1五类。其中同源异型-亮氨酸拉链蛋白（homeodomain-leucine zipper protein，HD-Zip）是近年来发现的由高等植物中特有的一类同源异型盒基因所编码的转录因子。

10. Ⅲ 碱性-亮氨酸拉链 该结构的特点是蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在α螺旋的同一个方向出现。两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，该二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。

11. Ⅳ 碱性-螺旋-环-螺旋 Ⅴ MYB结构域 MYB结构域是一段约51～53个氨基酸残基的肽段，包含一些高度保守的氨基酸残基和间隔序列，其中每隔约18个氨基酸残基则规则间隔色氨酸（W）残基，并参与空间结构中疏水核心的形成。MYB结构域折叠成螺旋-螺旋-转角-螺旋（helix-helix-turn-helix）结构，并且是植物中数量最多、功能最多样化的转录因子。

12. 转录因子的DNA结合域多为碱性，所含的氨基酸残基与顺式元件中的DNA碱基接触，决定该转录因子的专一性，其它残基则通过与DNA上的磷酸或脱氧核糖部分的非特异性互作来强化转录因子的结合；转录因子的DNA结合域多为碱性，所含的氨基酸残基与顺式元件中的DNA碱基接触，决定该转录因子的专一性，其它残基则通过与DNA上的磷酸或脱氧核糖部分的非特异性互作来强化转录因子的结合； • 识别碱基的氨基酸通常是高度保守的，例如：bZIP结构域中的1个精氨酸残基、锌指基序中的1个或2个半胱氨酸残基和组氨酸残基在植物、动物和真菌中是一致的； • DNA结合域中的这些氨基酸残基的空间排列对于其特异性是十分重要的，而特异性丧失的原因可能是由于半胱氨酸残基的位置改变而引起DNA结合域的三维结构改变造成的。

13. 转录因子DNA结合域的二级结构对于它们的亲和性和选择性也有影响，其中某些中性氨基酸残基如脯氨酸和甘氨酸就显得很重要。

14. 通常的转录因子只包含一种类型的DNA结合域，以单拷贝或多拷贝的形式存在。例如Myb蛋白是一种包含Myb结构域的转录因子，并首先在动物原癌基因中被发现。Myb结构域由3个拷贝的重复单位组成，每个重复单位含有约51~53个氨基酸，其中的3个色氨酸残基被18~19个其它的氨基酸所隔开，从而组成一个疏水核。第一个重复单位对于DNA结合是非必需的，而第二和第三个重复单位协同结合于Myb结合位点。这两个重复单位各含有3个α螺旋，其中第3个螺旋具有识别功能。通常的转录因子只包含一种类型的DNA结合域，以单拷贝或多拷贝的形式存在。例如Myb蛋白是一种包含Myb结构域的转录因子，并首先在动物原癌基因中被发现。Myb结构域由3个拷贝的重复单位组成，每个重复单位含有约51~53个氨基酸，其中的3个色氨酸残基被18~19个其它的氨基酸所隔开，从而组成一个疏水核。第一个重复单位对于DNA结合是非必需的，而第二和第三个重复单位协同结合于Myb结合位点。这两个重复单位各含有3个α螺旋，其中第3个螺旋具有识别功能。

15. 与动物相比，植物存在更多的Myb相关基因和蛋白，功能也更加多样化。已知大多数植物Myb蛋白含有两个拷贝的重复单位，类似于动物Myb蛋白中的第二个和第三个重复单位。 从功能上讲，植物Myb蛋白作为转录因子参与诸如类黄酮类化合物的生物合成、毛状体发育、分生组织增殖、GA应答以及干旱胁迫响应等信号转导过程。而编码植物Myb蛋白的myb相关基因 是一个很大的基因家族，因此也能调节发育进程以及参与对外界胁迫应答相关基因的表达。

16. 有些转录因子同时包含特异与非特异的DNA结合域，而且后者对于目标基因的转录激活是必需的； 有些转录因子同时包含特异与非特异的DNA结合域，而且后者对于目标基因的转录激活是必需的； • VP1是一种植物基因（包括小麦的Em基因）的转录因子，含有一个弱的非特异性的DNA结合域-BR2（B2）和一个序列特异的结合域BR3（B3），能够识别Sph元件（CATGCATG），而该元件存在于Em以及其它一些植物基因中。 • 有意思的是，VP1是通过BR2而非BR3来激活Em表达的，而这种依赖于BR2的调控需要14-3-3家族成员的参与，该家族最早是在哺乳动物（猪）脑部的可溶性蛋白提取物中发现的；14-3-3蛋白缺少DNA结合域，但能够将VP1和顺式元件特异的转录因子，如EmBP1（Em Binding Protein 1）与Em基因的启动子区域连接在一起。

17. 对植物的乙烯响应元件结合蛋白-1（ethylene-responsive element-binding protien-1）中保守的DNA结合基序、组成性光形态建成1（COP1）的类G蛋白β亚基基序和bZIP蛋白PEND中可能的跨膜结构域等的鉴定表明，转录因子中还可能存在新的功能域。

18. 转录活化域 在真核生物中，完整的转录调控功能通常以复合物的方式来完成，而并非每个转录因子都需要直接与DNA结合，因此具有转录活化域就成为转录因子中唯一必须具备的结构基础，而转录活化域也是真核生物调节结构域中的一种，此外还可能包括抑制结构域（repression domain）。

19. 转录因子的功能具有多样性，其转录活化域也有多种，通常是依赖于DNA结合域以外的30~100个氨基酸残基，包括富含酸性氨基酸、谷氨酰胺、脯氨酸等不同种类。有时一个转录因子上可包含一个以上的转录活化域，也可在融合蛋白分子中通过异源的转录活化域产生转录活化效应。转录因子的功能具有多样性，其转录活化域也有多种，通常是依赖于DNA结合域以外的30~100个氨基酸残基，包括富含酸性氨基酸、谷氨酰胺、脯氨酸等不同种类。有时一个转录因子上可包含一个以上的转录活化域，也可在融合蛋白分子中通过异源的转录活化域产生转录活化效应。

20. Ⅰ 带负电荷的α螺旋结构 哺乳动物细胞中糖皮质激素受体的两个转录活化域之一，以及AP1家族的Jun都有酸性的α螺旋结构，其对转录起始的特异诱导活性相对较低。

21. Ⅱ 富含谷氨酰胺的结构： SP1是启动子中GC盒的结合蛋白，共有4个参与转录活化的区域，其中最强区域的少有极性氨基酸，而富含谷氨酸胺。 哺乳动物细胞中的Oct1/2、Jun、AP2和SRF等转录因子都有同样的富含谷氨酰胺的结构域。

22. Ⅲ 富含脯氨酸的结构： CTF-NFl因子的C端富含脯氨酸（达20%~30%)，从而中断α螺旋的形成。在Oct2、Jun、AP2、SRF等哺乳动物转录因子中也有富含脯氨酸的结构域。 Ⅳ 含有不规则的双性α螺旋及其外的酸性氨基酸残基等。

23. 转录因子的激活结构域通常表现出序列多样性 点突变的研究表明，玉米 Myb类转录因子C1激活域的11个酸性氨基酸中只有1个256位的天冬氨酸残基是必需的，253位的亮氨酸残基也与表达激活有关，而对该结构域中的其它氨基酸的修饰则没有造成影响，说明激活域的功能只取决于个别氨基酸残基。对于单纯疱疹病毒转录因子VP16和通用型转录因子TFⅡB的研究也表明激活域的功能有赖于单个氨基酸残基间的互作。

24. 二聚体化结构域 许多转录因子能够形成异源/同源的二聚体形式，并影响DNA结合专一性、转录因子与启动子元件的亲和性及其细胞核定位。 二聚体通过螺旋和β-折叠之间的疏水作用或疏水氨基酸之间的相互作用来保持稳定。

25. 转录因子二聚体结构域的氨基酸序列通常是高度保守的，不同的类型都能与DNA结合域形成相应的不连续三维结构。例如在bZIP中的寡聚化结构域的特征是有规律的间隔排列的亮氨酸残基以及类似拉链的结构，bH-L-H则以螺旋-环-螺旋的结构为特征，而MADS因子的寡聚化结构域则形成2个α-螺旋和2个β-折叠的结构。 不同家族的转录因子的寡聚化结构域的长度有所不同，大多数bZIP类因子的亮氨酸拉链通常包含有4个或5个7单位重复，而在拟南芥的ATB2中则有9个。 另外寡聚化结构域以外区域的差异也会影响到其功能。

26. 细胞核定位信号 真核生物转录因子是选择性的进入细胞核的，因此转录因子也包含以富含精氨酸和赖氨酸核心肽为特征的NLS，而碱性核心区的功能也受旁侧残基的影响。转录因子中的NLS序列结构以及数目的变化较大，也可能在单个的NLS中的碱性氨基酸群由几个非保守的残基分隔。

27. 对转录因子的分类基于它们的结构特征 同一家族内有时又根据最相似结构域中保守残基的数目和间隔划分成亚家族。例如含有锌指的转录因子根据Cys（C）和 His（H）残基的数目和排列也还可以分为5类：C2H2、C3H、C2C2（GATA指），C3H4（环指（ring finger））和C2H5（LIM指）； 同一家族的转录因子也可以根据最保守区域以外的结构域来分类，例如植物同源异型盒转录因子又可分为KN1、HD-Zip、GLABRA2、PHD-Finger和BELL1五类。

28. 转录因子的抑制效应功能 同一家族的转录因子成员各自的独特功能来自于它们各不相同的调节结构域，该区域在各种因子间往往是不同的。调节结构域乃至转录因子本身，作为激活因子或抑制因子的功能取决于它们对靶基因的转录起的是激活还是抑制作用。

29. 转录因子可以通过与激活因子竞争结合同一个顺式元件，阻隔激活因子与顺式元件的接触来实现对靶基因表达的抑制；其他可能的抑制机制还包括转录因子对调节结构域的的二聚体屏蔽以及转录因子与抑制结构域的相互作用等。例如水稻的bZIP蛋白OsZIP-2a和2b，在体外能与小麦的bZIP转录因子EmBP1形成寡聚体，阻碍其与靶基因启动子的互作。同时转录因子中也可能有抑制结构域（repression domain）的存在。

30. 阴阳因子-1（Yin Yang-1，YY1）是一类新的转录因子，它通过与其它蛋白发生互作从而具有转录激活和阻遏功能，同时YY1也是核基质结合蛋白，其结合基序的多样性可能是其功能多样性的基础。 由于YY1的结合基序核心是 CCAT、ACAT、TCAT，其旁侧序列也具有很大的异质性，其结合基序的可变性很大程度上允许YY1结合和影响一大批基因的转录，而结合位点的可变性也使 YY1因子结合基序与大量其它因子的结合基序互相靠近或重叠，从而使转录调控更加严谨。

31. 转录因子活性和功能的调控 转录因子基因表达的特异性 真核生物转录因子基因的表达或是组成性的，或者以在特定的组织响应特定的刺激或依赖于特定发育阶段及细胞周期特异等方式表达。尽管转录因子基因家族的成员在表达的时间上可能有所差异，但它们的转录方式可能是相似和协同的，如BnGBF1a、1b和2a 3个GBFs在不同的器官和发育阶段中转录的比例是恒定的（1a>2a>1b），并且以光合作用活跃的叶片中转录的mRNA含量最高。

32. 转录因子基因还能对多种环境信号进行应答，例如由分子量为65 kD的DNA结合亚基Rel A和分子量为50 kD的p50蛋白质组成的复合体NF-κB是一种对氧化还原状态敏感的转录因子；玉米mLIP15（maize low-temperature-induced protein 15）是1个bZIP 因子，其转录本在降温、盐胁迫和外源ABA的诱导下均急剧增加。此外，同一转录因子家族的成员并非总是响应同样的刺激，HD-Zip家族的某些转录因子基因表达受光影响，而另一些则响应ABA和外源胁迫。因此，真核生物转录因子基因的表达可能与多种响应机制有关。

33. 通过转录因子基因本身的顺式元件来调控其表达通过转录因子基因本身的顺式元件来调控其表达 真核生物转录因子在调控靶基因表达的同时，其自身的活性也在各个层次上受到其它因子或元件的调节。通过抑制和过表达实验，诱导转录因子mRNA量的变化，将导致生物体发生多种变化，因此通过顺式和反式元件来精确的调控转录因子基因的表达可能有十分重要的作用。如拟南芥Myc相关转录因子基因Atmyc1在种子中的特异性表达是通过称作Sph盒（CATGCATG）的顺式元件来传递的。如果具有共同的顺式元件，调节和被调节基因有时会受到相同的转录因子的影响，而且有些转录因子基因的顺式元件还受到自身产物的调节。

34. 转录因子基因的转录后调控机理 在真核生物转录因子基因表达过程中也发现了mRNA的可变剪接，且产生的不完全相同的转录因子可能有着不同的调节功能。例如玉米的P基因通过改变mRNA前体3’ 端的剪接而产生两个转录本，大的编码包含有1802 个碱基且分子量为43.7 kD的蛋白，其N端与几个Myb蛋白家族成员的DNA结合域有40% 的同源性；小的编码包含有945个碱基，分子量为17.3kD的蛋白，且包含有Myb蛋白结构域的大部分。

35. 转运对真核生物转录因子活性的影响 通过一个选择性的过程进入细胞核，这是转录因子实现功能的先决条件。真核生物的核孔含有可以结合转录因子NLS的蛋白，NLS的突变会削弱与这些蛋白之间的互作。一些转录因子，如bZIP蛋白和HY5（hypocotyl 5）通常在细胞核内出现，但有许多转录因子的位置则受到环境刺激的影响。此外，还可以通过磷酸化来改变细胞系留因子（cytoplasmic retention factors），影响分子内和分子间NLS屏蔽（intra- and inter-molecular NLS masking），或者直接修饰NLS来调控许多转录因子运入细胞核。

36. 翻译后修饰对转录因子与DNA结合活性的影响 真核生物转录因子与DNA结合活性的调节可以通过蛋白质的磷酸化/脱磷酸化、胞内氧化还原调节等来实现，从而决定许多靶基因的表达。一些转录因子与DNA的互作因脱磷酸化而终止、磷酸化而激活，而对其它一些则反之或不受影响。例如玉米O2转录因子只有在脱磷酸化和低磷酸化状态下才能与DNA结合。

37. 目前认为，可能有几种激酶影响不同的真核生物转录因子与DNA的结合，但目前只有酪蛋白激酶Ⅱ和丝氨酸激酶已被证实，它们在胞质、细胞核或其它与转录机制相关的细胞器中起作用。 内外源的刺激都能影响到调节机制，例如bZIP转录因子HBP-1a的DNA结合域的丝氨酸残基的磷酸化是依赖于Ca2+的，而另一个bZIP因子Opaque 2（O2）的磷酸化则受节律钟控（circadian-clock-related）相关机制的控制。此外，玉米ZmMYBP蛋白在体外与靶DNA序列的结合需要ZmMYBP蛋白处于还原状态，推测MYB结构域中的一个由碱性氨基酸包围的高度保守的Cys残基是氧化还原调节的受体位点。

38. 与抑制蛋白（IN）的结合/解离以及是否二聚体化也是影响真核生物转录因子与DNA结合活性及其改变其功能的重要方面。与抑制蛋白（IN）的结合/解离以及是否二聚体化也是影响真核生物转录因子与DNA结合活性及其改变其功能的重要方面。 NF-κB亚单位P65的N端具有一个约300个氨基酸残基组成的Rel同源结构域（RHD），RHD上包含有DNA结合域、NLS和二聚体化结构域。 IκBα是NF-κB 的主要抑制因子，在细胞的静息状态下IκBα与NF-κB二聚体相结合并覆盖RHD上的NLS，NF-κB则以三聚体的形式被灭活。

39. 转录因子对靶基因转录的反式调控是一种组合控制（combination control） 真核生物中一组特定的转录因子结合到顺式元件上，这种高度有序的核蛋白复合物被称作增强体，其中的各成员之间的相互作用协同促进了与DNA的结合及转录的起始， 这种多个转录因子与 RNA聚合酶的复合体被看作是一种可装卸的转录机（transcription machinery），由于在某一特定的启动子上随着环境、发育阶段或其它信号不同，所形成的增强体的成分也不同，从而对基因的转录进行调控。

40. 真核生物基因转录因子活性和功能调节的示意图真核生物基因转录因子活性和功能调节的示意图

41. 不同类型的DNA结合域（如同源异型、锌指、亮氨酸拉链等）与不同类型的转录激活域可以组成结构与功能不完全相同的转录因子。 不同基因由不同的上游启动子元件组成，能与不同的转录因子结合，这些转录因子通过基础的转录复合体影响转录的效率。 许多不同的转录因子能与不同DNA序列相互作用，同一DNA序列也可被不同的转录因子所识别。有些转录因子可以直接结合DNA，但有些转录因子必须通过蛋白质-蛋白质相互作用与DNA序列联系并影响转录效率，不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域，但能通过激活域直接或间接作用于转录复合体，从而影响转录效率。

42. Thank you for your patience!