Tuomo Liljenbäck Ohjaajat: Fil.yo Ulla Karhunen ja FM Tiina Kokko

1. Homogeeninen multiparametrimääritys vapaalle ja kokonais-PSA:lle käyttäen terbium(III)-kelaattia donorina Tuomo Liljenbäck Ohjaajat: Fil.yo Ulla Karhunen ja FM Tiina Kokko MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Nuoret tutkijat 2008 / 11.3.2008 Arcanum

2. Johdanto • Työn tarkoitus • PSA • FRET • Määrityksen periaate

3. Työn tarkoitus • Tarkoitus on kehittää homogeeninen, multiparametrinen immunomääritys vapaalle ja kokonais-PSA:lle • Hyödynnetään homogeenisille määrityksille hyvin soveltuvaa fluoresenssiresonanssienergiansiirtoa (FRET) • Määrityksessä käytetään vasta-aineita, jotka tunnistavat joko vapaan ja/tai kompleksoituneen PSA:n

4. PSA • Prostata-spesifinen antigeeni (PSA) on paras ja käytetyin yksittäinen eturauhassyöpämerkkiaine • Eturauhassyöpä on yleisin länsimaisten miesten syöpä ja toiseksi suurin syöpään liittyvien kuolemien aiheuttaja • PSA:ta esiintyy verenkierrossa • vapaana • kompleksoituneena (yleensä α1-antikymotrypsiinin kanssa)

5. PSA • Seerumin korkea kokonais-PSA -pitoisuus voi johtua syövän lisäksi eturauhasen hyvänlaatuisesta liikakasvusta • PSA:ta käytetään tässä työssä mallianalyyttina • kaksi eri muotoa – soveltuu hyvin multiparametriseen määritykseen

6. FRET FRET vaatii lähekkäin (<10 nm) olevan luovuttaja- ja vastaanottajavärin, joiden emissio- ja viritysspektrit ovat osittain päällekkäin FRET-parin viritysaallonpituus ja emissioaallonpituus ovat kaukana toisistaan, joten määrityksen epäspesifinen tausta jää matalaksi Mittausaallonpituudet valittiin siten, että Tb(III)-kelaatin emissio olisi mahdollisimman matala

7. Määrityksen periaate

8. Määrityksen periaate

9. Spektrit

10. Materiaalit ja menetelmät Käytetyt vasta-aineet Leimaukset Määritykset

11. Käytetyt vasta-aineet • Kaikki monoklonaalisia • 5E4 • Sitoutuu vapaaseen ja kompleksoituneeseen PSA:han • H50 • Sitoutuu vapaaseen ja kompleksoituneeseen PSA:han • 5A10 • Sitoutuu vain vapaaseen PSA:han

12. Leimaukset Luovuttaja 5E4 Mab leimattiin terbium(III)-kelaatilla Vastaanottaja H50 ja 5A10 Mabit leimattiin Alexa Fluor 680:lla Myöhemmin H50 leimattiin myös Alexa Fluor 488:lla

13. Määritykset • Varsinaiset mittaukset • BSA-pinnoitetuissa kaivoissa 100 µl tilavuudessa • 50 ng kutakin vasta-ainetta • 2 x 45 min / 1 x 1h inkubointi huoneen lämmössä • Mittaukset tehtiin Victor 1240 monileimalaskimella (Perkin Elmer MA, USA), johon oli lisätty punaherkkä valomonistinputki (Hamamatsu PMT R4632).

14. Tulokset • Leima-asteet • Standardisuora • Kinetiikkatarkastelu • Multiparametrimääritys

15. Leima-asteet • Tb – 5E4 Mab (luovuttaja) • leima-aste 12,4 • AF 680 – 5A10 Mab (vastaanottaja) • leima-aste 4,6 • AF 680 – H50 Mab (vastaanottaja) • leima-aste 5,4 • AF 488 – H50 Mab (vastaanottaja) • leima-aste 5

16. Standardisuora y = 601,15x0,8378 R2 = 0,9976 y = 266,89x0,8662 R2 = 0,998 • AF 680 leimatut 5A10 ja H50 vastaanottaja-Mabit • Signaalin määrä kasvaa PSA-pitoisuuden noustessa

17. Kinetiikka • Kahden tunnin inkubointi ei muuta signaalin määrää

18. Multiparametrinen määritys

19. Päätelmät • Työssä on todistettu fluoresenssiresonanssienergiansiirron toimivan määrityksessä vapaalla PSA:lla • Vastaanottajavärin signaali kasvaa kummankin vasta-aineen kohdalla PSA:n määrän noustessa • Energiaa siirtyy myös, kun molemmat leimatut vasta-aineet ovat läsnä  Mittaukset voidaan tehdä multiparametrisesti

20. Mab Fab Alun perin määritys oli tarkoitus pystyttää käyttämällä Fabeja

21. Jatkossa • Optimoidaan vasta-aineiden määriä • Optimoidaan kinetiikkaa • Potilaspaneeli, jos aikaa jää

22. Kiitokset • Ohjaajat Ulla ja Tiina • Erikoistyöntekijät ja muu biotekniikan väki • Turun Yliopiston Kemistit TYK ry:n aktiivit