Glykolysen

1. Glykolysen Nedbryting av heksoser Winnie Eskild. IMBV 2004

2. Glykolysen • Glykolysen er nedbrytningsveien for glukose • Består av 10 trinn • Glykolysen deles i 2 deler: • Trinn 1-5: de forberedende reaksjonene hvor glukose aktiveres for nedbryting og spaltes i 2 molekyler bestående av 3 C-atomer. Dette koster energi i form av forbruk av 2 ATP • Trinn 6-10: her hentes det ut energi i form av ATP og elektroner

3. Forberedelsesfasen i glykolysen

4. Høstingsfasen i glykolysen

5. Betydningen av fosforylerte intermediater • Fosforylerte intermediater er ioniserte ved pH 7 og bærer altså en netto negativ ladning. Molekyler med netto-ladning kan ikke diffundere gjennom cellemembranen • Fosforylering er en måte å konservere energi på. Mye energi frigis ved hydrolyse av bindingene til fosfatgrupper • Fosfatgruppene bidrar til bindingsenergien som frigjøres fra enzym-substratkompleksene. Hjelper til å senke aktiveringsenergien og øke spesifisiteten i dannelsen av enzym-substratkomplekset

6. Glykolysen • Glukolysen er en oksidasjonsprosess hvor det er glukose som oksideres • Totalreaksjonen: Glukose + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 pyruvat + 2 NADH + 2 H+ + 2 ATP + 2 H2O • Som enhver annen redoksreaksjon kan denne deles i 2 halvreaksjoner 1) Glukose + 2 NAD+ => 2 pyruvat + 2 NADH + 2 H+DG’o = -146 kJ/mol 2) 2 ADP + 2 Pi => 2 ATP + H2O DG’o = 61 kJ/mol Totalt DG’o = -85 kJ/mol • I cellen er dette en irreversibel reaksjon • Vi henter ut ca 5% av det totale energi innholdet i glukosemolekylet, dvs mesteparten av energien ligger igjen i de 2 pyruvat molekylene • Energikonserveringen er på ca 60%

7. Dette er den første av to aktiveringsreaksjoner hvor cellen investerer ATP Enzymet er heksokinase som trenger Mg 2+for aktivitet Navnet heksokinase forteller at enzymet overfører en fosfatgruppe fra ATP til en heksose I cellen er denne reaksjonen irreversibel Fosforylering av glukose

8. Kinasenes reaksjonsmekanisme, trinn 1,3,7,10 • OH-gruppen på C-atom 6 retter et nukleofilt angrep mot g-fosfat-atomet i MgATP 2- • Fosforylgruppen overføres til C6 på glukose som blir til glc-6-P og ADP frigjøres

9. Her omdannes glukose-6-fosfat til fruktose-6-fosfat Denne isomerisering er reversible Enzymet er fosfoheksose isomerase og det er spesifikt for disse to substrater 2.reaksjon: omdannelse av glc-6-P til fru-6-P

10. Dette er den andre aktiverings-reaksjonen med forbruk av ATP Her settes en fosfatgruppe, P, på C-atom 1 Reaksjonen er irreversibel i cellen Reaksjonen er det viktigste reguleringspunktet i glykolysen Enzymet er allosterisk regulert 3. Reaksjon: Fosforylering av fru-6-P til fru-1,6-bisP

11. 4. Reaksjon: Spalting av fru-1,6-bisP til glyser-aldehyd-3-P og dihydroksyacetone • Enzymet er aldolase. Reaksjonen er en omvendt aldolkondensering • Reaksjonen er reversibel i cellen men drives frem ved rask fjerning av produktene +

12. 5. Reaksjon: isomerisering av dihydroksy-acetone-P til glyseraldehyd-3-P Revesibel isomering, enzymet er triosefosfat isomerase Avslutter aktiveringsfasen i glykolysen Cellen har forbrukt 2 ATP og omdannet en heksose til 2 triosemolekyler

13. Hvilke atomer havnet hvor?

15. Høstingsfasen i glykolysen

16. 6. Reaksjon: oksidasjon av glyseraldehyd-3-P til glyseraldehyd-1,3-bisP • Her starter fase 2 hvor energi ekstraheres • Enzymet er glyseraldehyd-3-P dehydrogenase • Substratets aldehydgruppe oksideres til en karboksylsyre-anhydrid og vi får dannet en acylfosfat • Acylfosfaten er spesielt energirik (DG’o = - 49,3 kJ/mol)

17. Glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase

18. 7. Reaksjon: overføring av fosfat fra 1,3-bisfosfoglyserat til ADP • Her overføres fosfatgruppen fra substratets C-1 til ADP • Enzymet er fosfoglyserat kinase • Reaksjonen er sterkt eksergon • Substratnivå fosforylering • DG’o = - 18,5 kJ/mol • Denne og forrige reaksjon er koplete med felles intermediat: 1,3-bisfosfo-glyserat. Total DG’o for de to reaksjonene er -12,5 kJ/mol

19. 8. Reaksjon: omdannelse av 3-fosfoglyserat til 2-fosfoglyserat • Her fosforyleres C-2 og C-3 defosforyleres • Enzymet er fosfoglyserat mutase som tilhører gruppen av isomeraser • Intermediatet er 2,3-bisfosfoglyserat som fungerer som kofaktor i denne reaksjonen • DG’o = 4,4 kJ/mol

21. 9. Reaksjon: dehydrering av 2-fosfoglyserat til fosfoenolpyruvat • Enzymet enolase katalyserer denne reaksjonen hvor det dannes en høyenergetisk fosfatbinding • Reaksjonen er en reversibel dehydrering hvor det dannes en dobbeltbinding mellom C-2 og C-3 • Herved omfordeles energien i molekylet. Fraspaltning av fosfatgruppen ved hydrolyse frigir svært mye energi

22. 10. Reaksjon: overføring av fosfatgruppen fra fosfoenolpyruvat til ADP • Her overføres fosfatgruppen fra fosfoenolpyruvat til ADP i en eksergon reaksjon • Enzymet er pyruvat kinase • Substrat nivå fosforylering • Pyruvat tautomeriserer, ketoformen dominerer • Direkte hydrolyse av fosfoenol-pyruvat ville hatt DG’o = - 61,9 kJ/mol og tilhører dermed gruppen av svært høyenergetiske molekyler • Viktig reguleringspunkt for glykolysen

23. Tautomerisering driver reaksjonen • Hydrolyse av fosfoenolpyruvat har DG’o = -16 kJ/mol • Tautomerisering av enolpyruvat har DG’o = -46 kJ/mol • Totalreaksjonen har DG’o = -62 kJ/mol • Dannelse av ATP fra ADP + Pi har DG’o = 30,5 kJ/mol • PEP + ADP + Pi Pyr + ATP har DG’o = -31,5 kJ/mol dvs en sterkt eksergon reaksjon

25. Total reaksjon for glykolysen • Glukose + 2 ATP + 2 NAD+ + 4 ADP + 2 Pi 2 pyruvat + 2 ADP + 2 NADH + 2 H+ + 4 ATP + 2 H2O • Denne forenkles til: Glukose + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 pyruvat + 2 NADH + 2 H+ + 2 ATP + 2 H2O • Nettoutbytte: 2 ATP + 4 elektroner • Ca 95% av energien finnes ennå i de 2 pyruvat molekylene

26. Endring i fri Gibbs energi gjennom glykolysen • Reaksjon 1, 3, 10 har stor negativ DG’o og er i praksis irreversible • Disse 3 reaksjoner er de viktigste reguleringtrinn i glykolysen. De katalyseres av: • 1) Heksokinase • 3) Fosfofruktokinase 1 • 10) Pyruvat kinase

27. Glykolysens enzymer danner multikompleks • De 10 enzymene i glykolysen danner et multikompleks • Muliggjør kanalisering av substratene, dvs ene enzyms produkt er neste enzyms substrat. Dette øker hastigheten i omdannelsen av glukose til pyruvat • Flere av enzymene er vist å assosiere med forskjellige organeller => lokalisering av glykolysekompleksene

28. Glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase Fosfoglyserat kinase

29. Aerobe forhold Pyruvat omdannes til acetylCoA og sendes videre til sitronsyresyklusen hvor elektroner ekstraheres (oksidasjon) og bare CO2 er igjen Anaerobe forhold Pyruvat omdannes til laktat eller etanol avhengig av organisme Pyruvats videre skjebne

30. Pyruvat => laktat • Pyruvat omdannes til laktat av enzymet laktat dehydrogenase som benytter NAD+ som kofaktor. • Dette er en oksidasjonsreaksjon hvor 2 elektroner overføres til NAD+ som omdannes til NADH + H+ • Dette skjer f.eks. i muskler under intenst arbeid hvor det ikke er tilstrekkelig oksygen tilstede • Reaksjonen sikrer at NAD+ regenereres slik at glykolysen ikke stopper opp på grunn av mangel på NAD+

31. NAD+ må regenereres • Under anaerobe forhold tar cellens NAD+ fort slutt • Pyruvat omdannes til laktat for å få gjendannet NAD+ • Uten NAD+ kan glukose ikke omdannes til pyruvat og dermed stopper produksjon av ATP fullstendig = død • Anaerob glykolyse gir 2 ATP pr glukose molekyle

32. Pyruvat omdannes først til acealdehyd i en reaksjon katalysert av pyruvat dekarboksylase. Enzymet benytter TPP (thiamin pyrofosfat) som kofaktor og er avhengig av Mg 2+ Acetaldehyd reduseres dernest til etanol av alkohol dehydrogenase. Enzymet benytter NADH som kofaktor Pyruvat => etanol Dette skjer i mikroorganismerOmdannelsen er en 2-trinns-prosess

35. Dekarboksylering • Pyruvat dekarboksylase ondanner pyruvat til acetaldehyd • Enzymet krever Mg2+ og har tiaminpyrofosfat (TPP) som koenzym • TPP danner en karbanion ved dissosiasjon av en H+ • Karbanionen retter nukleofilt angrep mot pyruvat og danner kovalent binding • Karboksylgruppen spaltes fra • TPPs thiazoliumring stabiliserer intermediatet • Hydroksyethyl protoniseres på TPP og frigjøres som acetaldehyd 1 2 3 4

36. Omdannelse av pyruvat til CO2 og H2O • Under aerobe forhold sendes pyruvat inn i sitronsyresyklusen hvor det oksideres fullstendig • Denne prosess gir 30-32 ATP pr glukosemolekyle

38. Substrater for glykolysen • Nedbryting av glykogen og stivelse frigir glukose • Brytes ned fra den ikke-reduserende enden • To enzymer er involvert: • Glykogen fosforylase: fosforolyse => glukose-1-fosfat som produkt • Enzymet spalter a1->4 glykosidbindnínger ned til 4 monosakkarider fra forgreningspunktet • ”debranching” enzym • spalter a1->6 glykosidbindinger og flytter en tetramonosakkarid til den ikke-reduserende enden på glykogen • Glukose-1-fosfat må omdannes til glukose-6-fosfat før den kan gå inn i glykolysen • Fosfoglukomutase katalyserer denne reaksjonen • Reaksjonen går i 2 trinn. Først fosforyleres glc-1-P på C-6, deretter defosforyleres glc-1,6-bisP på C-1. Enzymet har et fosforylert Ser i det aktive setet som både donerer fosfatgruppen og fungerer som kofaktor

39. Nedbrytning av glykogen

40. Debranching

41. Takk for idag

42. Regulering av glykolysen • Tre viktige reguleringspunkter: heksokinase, fosfofruktokinase 1 og pyruvat kinase • Dannelse av produkt i de fleste enzymkatalyserte reaksjoner er bestmet av tilgangen på substrat • Dette gjelder ikke disse regulerte enzymer som er allosterisk regulert • Her bestemmer andre forhold hvor mye produkt som skal dannes uansett tilgang på substrat AMP Fructose 2,6- bisphosphate

43. Hastighetsbegrensende reaksjoner • Rate-limiting steps • Disse enzymkontrollerte reaksjoner finnes hvor et substrat kan ta flere veier • Cellen er avhengig av å ha en konstant nivå av ATP hele tiden • Cellens behov varierer fra minutt til minutt og alle enzymkontrollerte reaksjonsveier er avstemt etter behovene

44. Regulering av heksokinase • Heksokinase er allosterisk regulert av sitt eget produkt • Heksokinasen i muskel har lav Km (0,1 mM). Dette enzymet arbeider i takt med tilgang på substrat hele tiden • Heksokinase isoenzymet i lever heter glukokinase. Dette enzymet har høy Km (10 mM), dvs det arbeider bare i høy hastighet ved høye nivåer av glukose i blodet • Normale blodglukosenivåer er ca 4-5 mM • Glukokinase hemmes av fruktose-6-fosfat

45. Regulering av fosfofruktokinase 1 • Dette enzymet kontrollerer ”the point of no return” i glykolysen • Når glukose har passert denne enzymreaksjon kan det bare fortsette videre i glykolysen • Enzymet er allosterisk regulert: • Stimulerende effekter: ADP, AMP, fruktose-2,6-bisfosfat • Hemmende effekter: ATP, citrat (forsterker ATPs hemmende effekt)

46. Fosfofruktokinase 1 • Viktigste reguleringspunkt i glykolysen • Lav ATP senker K 0,5 , dvs maksimal hastighet oppnås ved lavere konsentrasjoner

47. Regulering av pyruvat kinase • Det finnes 3 isoenzymer som har vevsspesifikk ekspression • Høye nivåer av ATP hemmer aktiviteten ved å øke K 0,5 • Andre hemmere: acetyl-CoA, langkjedete fettsyrer, fru-1,6-bisfosfat

48. Regulering av glukoneogensen • Glukoneogesen bruker mere energi til å bygge et molekyle glukose enn cellen kan ekstrahere fra samme glukosemolekyle når det brytes ned til pyruvat • Derfor er det svært viktig at disse to motsatt rettede prosesser ikke foregår samtidig • Det er to viktige reguleringspunkter: Pyruvat karboksylase og fruktose 1,6-bisfosfatase

49. Regulering av glukoneogensen • Nivå av acetyl-CoA regulerer pyruvats metabolske skjebne • Når cellen har tilstrekkelig energi, reduseres hastigheten på oksidativ fosforylering ( mangel på ADP). Dette fører til redusert hastighet i sitronsyre-syklus og dermed opphoping av acetyl-CoA • Økte nivåer av acetyl-CoA stimulerer pyruvat karboksylase og dermed glukoneogenesen • Samtidig hemmer de høye nivåene av acetylCoA pyruvat dehydrogenase komplekset slik at det ikke dannes mere acetyl-CoA

50. Regulering av glukoneogensen • Glukoneogenesens nedbryting av fruktose 1,6-bisfosfat hemmes av AMP som samtidig stimulerer glykolysens fosfofruktokinase1. • Fruktose 1,6-bisfosfatse stimuleres ikke direkte av noe men fosfofruktokinase1 hemmes av høye nivåer av ATP og citrat som begge signaliserer at cellen har tilstrekkelig energi