第十四章 蛋白质与氨基酸分析
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第十四章 蛋白质与氨基酸分析. [email protected] 第一节 概 述. 第一节 概 述. 蛋白质测定的方法分类 利用蛋白质中含氮进行测定:开氏定氮 基本概念: 1 、蛋白质与粗蛋白质 2 、蛋白质系数 利用蛋白质的理化性质测定 染色反应 双缩脲反应 萤光反应 红外光谱. 氮 - 蛋白质换算系数. 第二节 蛋白质的测定. 一、常量法 新鲜鱼、肉、蛋及含硝态氮较多的蔬菜等样品粗蛋白质的测定(硫酸 - 催化剂消煮法) 植物、动物饲料中粗蛋白质的测定 硫酸 - 催化剂消煮 —— 半微量开氏法

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第十四章 蛋白质与氨基酸分析

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第十四章 蛋白质与氨基酸分析

[email protected]


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第一节 概 述


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第一节 概 述

蛋白质测定的方法分类

  • 利用蛋白质中含氮进行测定:开氏定氮

    • 基本概念: 1、蛋白质与粗蛋白质

      2、蛋白质系数

  • 利用蛋白质的理化性质测定

    • 染色反应

    • 双缩脲反应

    • 萤光反应

    • 红外光谱


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氮-蛋白质换算系数


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第二节 蛋白质的测定

一、常量法

  • 新鲜鱼、肉、蛋及含硝态氮较多的蔬菜等样品粗蛋白质的测定(硫酸-催化剂消煮法)

  • 植物、动物饲料中粗蛋白质的测定

    • 硫酸-催化剂消煮——半微量开氏法

    • 硫酸-双氧水消煮法——纳氏比色法

      (蒸馏法、比色法,扩散法,电极法测定)

      方法原理操作过程方法要点

      问题:1、纯蛋白质如何测定?

      2、为什么含硝态氮较多的样品必须用硫酸-催化剂消煮?


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二、同类种籽中粗蛋白质测定

(一)染料结合法(DBC法)

  • 方法原理

    • 蛋白质含有一定组成的碱性氨基酸(赖氨酸、精氮酸和组氮酸),其中的ε –NH2、咪唑基、胍基和蛋白质的末端自由基在pH2~3缓冲体系中呈阳离子状态,可与偶氮染料(桔黄G、酸性橙12)等结合而沉淀,通过测定染料颜色的降低求出蛋白质的含量。比色波长为482nm.

桔红G


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问题

  • 为什么只能直接测定同类种籽中蛋白质的相对量?

  • 为什么染料溶液的pH、样品的粒度、振荡反应的时间与温度影响测定结果?

  • 为什么称样量应视蛋白质含量而定?

  • 普通分光光度计要稀释50倍比色。


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染料结合法测定蛋白质含量的影响因素

1、染料浓度对染料结合量的影响

从图2中可看出,染料浓度越大,染料的结合量越大。

为了减少工作量和降低稀释误差,应采用适宜的染料浓度,以0.04%的染煽动浓度为宜。


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2、样品粒度对染料结合量的影响

从图3中可看出,样品粒度越细,蛋白质的碱性基团暴露越多,染料的结合量越大。

测定时,所用样品的粒度应基本一致。


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3、酸度对染料结合量的影响

从图4中可看出,缓冲液的酸度影响到蛋白质中氨基酸残基所带电荷数。pH越高,其所带的电荷越少减少,染料的结合量越小,吸收A值越大。


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4、振荡时间与温度对染料结合量的影响

时间和温度对染料结合量均有影响。温度既可提高反应速度, 又可提高反应程度,但提高的程度不大,在±5 ℃对实验结果影响不大。

在室温下反应2h即可。


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(二)双缩脲法

  • 方法原理

    • 蛋白质含的肽键含有类似天双缩脲基团(R-CH-CO-NH-CH-CO-R),能起双缩脲反应。

    • 即在碱性条件下与铜离子生成紫红色可溶性络合物。蛋白质含肽键多时呈紫色,反之为红色。蛋白质含量在1~15mg时,其呈色反应符合比耳定律。比色波长为550nm.


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方法要点

  • 样品的颜色对测定有影响

  • 温度和显色时间要求严格,否则重现性不高。(室温120~190min内比色, 40℃时15~70min比色)

  • 须用6000rpm离心10min以上,才可能澄清比色液。

  • 其它同染料结合法。


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(三)荧光法

  • 方法原理

    • 荧光染料亮磺化黄素与碱性氨基酸络合,生成的络合物在430nm激发光下产生波长为510nm的荧光。荧光强度与碱性氨基酸、蛋白质含量成正比。


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操作过程:

120目样品50mg→离心管→5mL磷酸二氢钠-柠檬酸(pH2.2)5mL →2000rpm离心5min,弃上清液→5mL染料,室温振荡1h → 2000rpm离心5min,弃上清液(水洗1~2次)→沉淀悬浮于5mL水中进行荧光测定。

  • 方法要点。

    • 只能测出同类种籽中蛋白质含量的相对量。

    • 注意荧光猝灭。

    • 其它同染料结合法。


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三、植物组织中可溶性蛋白质的测定

(一)斐林—酚法(folin-酚法或Lowry法)

  • 方法原理

    Folin-酚试剂法包括两步反应:

    • 第一步是在碱性条件下,蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物;

    • 第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin 试剂)还原,产生深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物),颜色深浅与蛋白质含量成正比。

    • 比色波长为550nm.以小牛血清蛋白质作0~250ppm标准曲线。


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  • 此法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100 倍,定量范围为5~100μg 蛋白质。

  • Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起,因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。

  • 不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。


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操作过程

  • 5g鲜样+5mL水研磨g→10000rpm离心10min →上清液1mL至试管→ 5mL斐林试剂→ 30℃下10min → 0.5mL磷钼酸/磷钨酸→ 显色10min,650nm比色。


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(二)考马斯亮蓝法

方法原理

考马斯亮蓝(Comassie brilliant blue)G250是一种阴离子染料,在酸性介质中呈橙色,与蛋白质分子内带阳电荷的赖氨酸、精氨酸及组氨酸残基结合后变为蓝色,最大吸光在465nm,与蛋白质浓度成正比。

此显色反应快,约2min即可反应完全。生成的复合物约在1h内稳定,然后发生聚合并沉淀出来。

通过与标准血清蛋白质试样比较可求出样品蛋白质的含量。


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本法灵敏度为Lowry 法的4-5 倍,测定范围10-100μg蛋白质,微量法为1-10μg蛋白质。

此反应重复性好,线性关系好,精确度高。标准曲线在蛋白质浓度较大时可稍有弯曲,但不影响测定。蛋白质与染料结合量不相同,测定与标准蛋白质组成有较大差异的样品时,有一定误差。

本法干扰性物质少,少数物质如强碱性缓冲剂、蔗糖、甘油及乙酸等有一些颜色干扰,可用适当对照液消除掉。另如1%十二烷基硫酸钠(SDS)等则干扰严重,应避免参入。由于酚类及氨基酸不干扰,使其在测定生物体液或医药品中微量蛋白质时有独特的优点。

1976 年提出,现有取代Lowry 法的趋势。


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(三)紫外吸收法测定蛋白质含量

  • 方法原理

    由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸,因此蛋白质具有吸收紫外光的性质,最大吸收峰在280nm 波长处。在此波长范围内,蛋白质溶液的光密度OD280nm 与其浓度呈正比关系,可作定量测定。

    通过与标准小牛血清蛋白质相比求蛋白质含量。


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1.在测定工作中,可以利用280nm 及260 nm 的光密度值求出蛋白质的浓度:

蛋白质浓度(mg/mL)=1.45OD280nm―0.74OD260nm

式中:OD280nm是蛋白质溶液在280nm 下测得

的光密度;

OD260nm是蛋白质溶液在260nm下测得

的光密度。


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2.对于有核酸存在时所造成的误差,可将待测的蛋白质溶液稀释至光密度在0.2~2.0之间,选用光程为1cm 的石英比色杯,在280nm 及260nm 处分别测出光密度OD280nm/OD260nm 的比值,从表2 中查出校正因子“F”值,同时可查出该样品内混杂的核酸的百分含量,将F 值代入下述公式,即可计算出该溶液的蛋白质浓度。

蛋白质浓度(mg/mL)= F×OD280×D

式中:OD280为被测溶液在280nm 紫外波长下的光密度,D 为溶液的稀释倍数。


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第二节 氨基酸的测定

  • 目前氨基酸的主要测定方法:

  • 容量法;

  • 比色法;

  • 色谱法;

    • 薄层层析法;

    • AA分析仪法、HPLC法。

  • 荧光法;

  • 电化学法;

  • 化学发光法;

    • 在碱性介质中,谷氨酸对硫氰化钾 -鲁米诺化学发光体系有增敏作用。

  • 红外光谱法等。


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氨基酸分析的一般过程

  • 待测定液的制备

    • 游离氨基酸的浸提;

    • 全氨基酸组分测定时蛋白质的水解。

  • 测定

    • 标样的准备;

    • 各氨基酸组分的测定


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游离氨基酸的浸提

  • 液体试样(包括含CO2或酒精性饮料)直接取样或适量稀释后取样;

  • 果蔬试样直接榨汁或用组织捣碎机捣成匀浆,取5~1g(或ml)于50ml或100ml量瓶内,加30%H2O2 3~5滴,水稀释至刻度(若溶液浑浊,离心或滤纸过滤)待测定。

  • (有的分析要求用乙醇浸提)


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全氨基酸组分测定样品的水解

  • 准确称取样品0.1 ~ 0.2g于18  20mm硬质玻璃试管中,加6mol/L HCI及十氢萘1滴。在酒精喷灯上将试管上部3~4cm处拉成2~smm的细颈(如图1所示)。抽真空15min,真空下封管,于110士1℃水解16~18h。水解完成后定容至50mL。静置橙清取清液lmL用Sep-Pack C18预柱滤于50mL烧杯中。在65℃水浴上蒸干,加两滴去离子水再蒸干,冷却后加2~5mL 0.02mol/L HCI,然后上机测定。

含硫氨基酸(如胱氨酸和色氨酸)易分解,需专门的水解步骤进行。


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氨基酸分析样品水解方法之二

  • 1.一般水解程序

  • 取含蛋白质约10mg的量→置于水解管→6 mol·L-1 HCl10mL(液体样加等量的浓盐酸)→脱气其密封→110℃水解22h→水解管开封→旋转蒸发器去除盐酸→干涸后,用蒸馏水溶解→ 50℃以下再次干涸→溶于10mL 的柠檬酸钠缓(pH-2)冲溶液中→ 上机分析。


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氨基酸分析样品水解

2. 胱氨酸及色氨酸的水解。

  • (1) 胱氨酸:将含有胱氨酸 0.25~1.00 mol的试样溶于88%甲酸10mL 中 →取此试样溶液 0.5mL 置于具塞试管中→ 加入过甲酸溶液(30%H2O2和88%甲酸按溶积1∶9的比例混合,室温下放置1h后使用)2mL → 在0℃下放置4h →旋转蒸发器去除过甲酸→用含2~4% -巯基乙醇的6mol·L-1 HCl溶液按上步骤水解。

  • (2) 色氨酸:取含色氨酸1~2mg试样→聚乙烯管中, 将此管封在玻璃管中 →加入4.2mol.L-1氢氧化钠溶液100mL和 硫代二甘醇0.3mL →脱气封管→ 110℃下水解24h →分解物用 6mol·L-1 HCl 7mL中和→再用pH4.2的柠檬酸缓冲溶液调整pH 为4.5,定容至一定量。


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氨基酸分析样品水解

  • 3. 植物性产品水解

  • 取粉碎样20~50g 置于最终浓度为750mL·L-1乙醇中→取10mL均化器均质→移入茄形烧瓶中→ 80℃加热回流15min →泠却→瓷漏斗过滤→残渣用75%乙醇50mL再提取两次,滤液合并定容至250mL,在-20℃下放置一夜[有沉淀时,用玻璃过滤器(G-3)过滤或离心分离(6000r·min-1,10min) ]→旋转蒸发器去除水分, →干涸物溶于试样稀释用的缓冲溶液中。


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氨基酸分析仪的一般程序

  • (1)样品的水解。

  • (2) 试样中氨基酸浓度的估量,上机分析氨基酸浓度1~10nmol/50l范围为宜。

  • (3)分析前的仪器检查:一般有水浴及反应槽的温度,泵的流速,缓冲液,茚三酮试剂以及N2气压力等仪器的各种性能检查。

  • (4)设定分析程序——按仪器说明书推荐使用的分析程序操作。

  • (5) 分析混合氨基酸标准样层析图谱的各种参数。

  • (6) 试样的分析:最后仪器分析试样,打印出全氨基酸的色谱图,以绘出各氨基酸组分的纳克数。然后将按试样的质量,稀释倍数及试样水分系数等,计算其结果。


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O

+HCHO

NaOH

R-C-C

R-CH-COOH

R-CH-COONa

R-CH-COOH

H3N-O

NH2

N=CH2

N=CH2

氨基酸总量的测定——甲醛滴定法

  • 方法原理

    氨基酸具有酸性的-COOH和碱性的-NH2,它们互相作用使氨基酸成中性的内盐。加入甲醛时, NH2与甲醛结合,其碱性消失,这样就可以用酚酞作指示剂,以标准碱来滴定-COOH,用间接的方法测定氨基酸的含量。


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甲醛法测定氨基酸的评述

  • 作为定量方法,我国推荐甲醛值法作为标准方法,该法虽有较好准确度,但存在以下间题:

  • 方法的灵敏度低,尤其是对饮料中原汁含量较低的样品,往往检不出;对含碳酸型及酒精型的饮料,需除去CO2和乙醇才能测定;滴定终点不易掌握,甲醛浓度滴定速度等要求苛刻;取样量大、分析速度慢、消耗溶剂多。

  • 色深样品需用电位滴定等。


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氨基酸总量的测定——茚三酮比色法

  • 方法原理

    氨基酸在一定pH条件下与水合茚三酮反应,生成蓝紫色化合物,可比色定量。


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氨基酸分析仪法

  • 方法原理:

    氨基酸分析仪的中心是离子交换层析柱,当流动相(缓冲溶液)推动氨基酸流经装有阳离子交换树脂的色谱柱时,氨基酸与树脂中的交换基团进行离子交换,当用不同pH值的缓冲溶液进行洗脱时,因交换能力的不同而将氨基酸混合物分开,流出色谱柱的氨基酸再与茚三酮在100℃下反应生成紫色物质茚二酮炔-茚二酮胺(DYDA),显色后的氨基酸由光度计检测。

    大多数氨基酸与茚三酮均有此反应,所形成的DYDA在570nm处有最大的吸收峰。但脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质,在440nm处有一吸收峰,通过光度计对这两个波段的检测,由记录器给出层析图谱,附有数据处理机的氨基酸自动分析仪可直接给出50g样品中含有各种氨基酸的纳克(ng)数。


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茚三酮

缓冲液1

缓冲液2

缓冲液3

缓冲液4

再生液

氨基酸分析仪工作流程

电磁阀

多支管

混合器

反应槽

比色计

记录仪


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蛋白质水解物分析用缓冲溶液


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水合茚三酮配制表


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氨基酸的分离与鉴定——薄层层析法

  • 方法原理

    水解样液滴在微晶纤维板上,在溶剂系统中进行双向上行法展开,由于氨基酸的吸附力和Rf值不同而分离,用茚三酮喷雾显色,与标准氨基酸图谱相比较进行定性和定量。

  • 操作:

    15g 微晶纤维素+30mL水+4mL丙酮→匀浆后涂成0.5mm厚板(玻璃板200×200mm,厚3mm) →取水解样5微升点样→先进行碱展开→翻转90度→酸展开→茚三酮显色→与标准图谱相比定性和定量。

    其它分析方法:

    气相色谱法——转化三氟乙酰基二丁酯后上机。

    液相色谱法——丹磺酰氯进行衍生化后溶于流动相中,上机测定。


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AAS法测水溶性氨基酸总量

  • 方法原理:

    用甲基异丁酮和丁醇的混合溶剂萃取样品,,再用难溶性的Cu3(PO4)2与氨基酸反应,生成溶于水的氨基酸Cu络合物,离心沉降未反应的Cu盐,用原子吸收法测定上层清液中的Cu可间接测定茶叶中的氨基酸。(本方法所得结果与分光光度法的结果非常一致。)

    Cu3(PO4)2悬浮液:将CuCI2和Na3PO4溶液混合,按倾泻法制备。


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谷物和饲料中赖氨酸的测定——染料结合赖氨酸法-DBL法)

  • 方法原理

  • 染料结合法可用于测定样品中蛋白质的碱性氨基酸,包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。如果先将样品用丙酸酐处理,丙酸酐便将赖氨酸的-NH2的酰化掩蔽,使其失去了和染料结合的能力。 其反应如下:

    O O

    

    赖氨酸的—NH2 + CH3—CH2—C—O—C—CH2—CH3 

    O 丙酸酐

    

    —HN—C—CH2—CH3 + CH3—CH2—COOH

    丙酰 丙酸

  • 然后分别测定酰化前后的DBC值。酰化前的测定值为赖氨酸+组氨酸+精氨酸。而酰化后只是组氨酸+精氨酸。

  • 以上两项测定结果的差值,就可计算出赖氨酸的含量。


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谷物、油料籽粒的称样量


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ε -TNP-赖氨酸(黄色)

γ -TNP-赖氨酸

TNPS

谷物和饲料中赖氨酸的测定——TNBS法)

  • 方法原理

    2,4,6-三硝基苯-1-磺酸(TNBS)与赖氨酸结合后溶液中有三种物质:

乙醚萃取,弃醚层

水相除醚后,

346nm处比色测定

溶于乙醚


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色氨酸的测定—乙醛酸法

  • 方法原理:

    谷物中蛋白质经木瓜蛋白酶作用水解出色氨酸,然后在浓硫酸存在的情况下,Fe3+可将乙酸氧化为乙醛酸,2mol色氨酸能与1mol乙醛酸缩合,产生Hopkins-cole反应,生成红紫色的化合物,其红紫色的强度与色氨酸的含量在一定范围内成正比,其最大的吸收峰在545nm,可进行比色测定。

  • 要点:

    冰醋酸中必须含有低量的乙醛和高含量的乙醛酸,否则不形成颜色,可在混合显色剂中加入的80mL·L-1乙酸酐,解决显色问题。


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