1 / 30

Oversikt over oppgaven

Oversikt over oppgaven. Forsøk 1. ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA. Jurkat celler (T-lymfocytter). HL60 celler (Myeloide celler). HeLa celler (Cervix celler). Forsøk 2. Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) PP1. RNA isolering. RT: cDNA-syntese med revers transkriptase. Forsøk 3.

roy
Download Presentation

Oversikt over oppgaven

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Oversikt over oppgaven Forsøk 1 ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) Forsøk 2 • Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) • PP1 RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Forsøk 3 Real-time PCR • Test av celletype- spesifikk mRNA • c-myb Lightcycler Kvantitering av spesifikke mRNAs

  2. Ulike mønstre av mRNA uttrykk • Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA • Noen er de samme i alle celler og blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener) • Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener). • I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse mRNA mRNA cDNA cDNA Kvantitering ReferanseUkjent

  3. The quantitative assay - step by step • Primer design • RNA isolation • cDNA synthesis • Set up of the experiment • Programming and running the LightCycler • Optimizing the PCR reaction • Interpretation of the results • Troubleshooting 1 2 3 4 5 6 7 8

  4. Stage 1: Primer design • Length: 18-24 bp • Try to make the two primers equal in length • GC content: • Between 40% and 60% with equal GC content in both primers • Avoid an unbalanced distribution of G/C and A/T-rich domains • Sequence: • 3´-region most important, free of secondary structures, repetive sequences, palindromes, and highly degenerate sequences • Last 5 nucleotides should contain no more than 2 G/C • Melting temperatures • Tm = temp at which 50% of the primer-target hybrids are single stranded. • Depends on primer sequence and buffer composition • Tm between 55-65oC, primers used together should have similar Tm value 1 2 3 4 5 6 7 8

  5. 2. step: RNA isolation • Several methods • GTC metoden • Trizol metoden • Ulike kommersielle kit • Kits for cultured cells • 5 x 106 cells/prep, • expected yield: 10-20 ug/ 106 cells 1 2 3 4 5 6 7 8

  6. Pre-mRNA (hnRNA) AAAAAAAAAAAAA cap mRNA Arbeid med RNA er krevendepga RNA lett degraderes • RNA er et labilt molekyl som lett degraderes • Pga 2´-OH som deltar i degraderings-mekanismen • Pga RNAser som finnes overalt (fingre etc) og som er svært robuste enzymer (noen tåler koking). • RNA er derfor langt mer ustabilt enn DNA • I cellene er mRNA beskyttet dels med ende-modifikasjoner, dels via assosiasjon med protein • Arbeid med RNA krever derfor særlig forsiktighet 1 2 3 4 5 6 7 8

  7. Tiltak for å unngå RNA degradering • Unngå RNaser (allestedsnærværende) • Bruk hansker (men ha ikke blind tiltro til hvor effektive de er) • Løsninger behandles med DEPC (diethylpyrocarbonate) • Bruk RNase-frie rør og pipettespisser (helst med filter) • Elektroforesekar behandles med H2O2 • Glass og metall varmebehandles: 180 oC minst 8 timer • Bruk RNase inhibitorer • DEPC (diethylpyrocarbonate) er et reaktivt alkyleringsagens • Vanadyl ribonucleoside komplekser - ikke-kovalent inhibitors, må fjernes før RNA skal brukes videre pga inhibering av polymeraser • Protein inhibitorer - et ca 50 kDa cytoplasmatisk inhibitor protein isolert fra placenta binder sterkt til og inhiberer mange Rnaser (kommersielle navn: RNasin, prime inhibitor etc) 1 2 3 4 5 6 7 8

  8. O C-CH2-CH3 O C-CH2-CH3 O Inhibitorer av Rnaser - DEPC • DEPC (diethylpyrocarbonate) • DEPC er et reaktivt alkyleringsagens som inaktiverer RNaser i buffere og på glassutstyr. • Modifiserer Histidine grupper med ethoxyformyl • DEPC reagerer med RNA og protein generelt, og kan derfor ikke brukes under isolering. • Inaktiveres raskt i vann (halveringstid ca 10 min ved pH 7) og omdannes til CO2 og etanol. Bør ikke brukes sammen med Tris. • Bruk: 0.1% DEPC i vann overnatt ved rom temp (eller 1 time 37oC) etterfulgt av vask med DEPC-behandlet vann og autoklavering 1 2 3 4 5 6 7 8

  9. Hvordan isolerer vi RNA? • Kit for RNA isolering • The Absolutely RNATM RT-PCR miniprep kit • Prinsipp • Celler lyseres i nærvær av guanidin thiocyanat, en av de sterkeste kjente protein denaturanter, som inaktiverer Rnaser • Pre-filter spin fjerner partikler og noe DNA • RNA blir absorbert til en silika-basert fiber-matriks i nærvær av høye konsentrasjoner chaotropiske salter (mens kontaminanter vaskes ut).

  10. Hvordan isolerer vi RNA? • Prinsipp forts. • Vask med lav-salt buffer • Rester av DNA fjernes med DNase behandling • Videre vask fjerner protein og rester av DNase • Høy-renset RNA isoleres i et lite volum ved eluering med en buffer med lav ionestyrke og samles opp i mikrosentrifuge-røret • Renset RNA • Har lavere DNA-innhold enn mange metoder • Er derfor velegnet for RT-PCR og real-time PCR analyser

  11. 3. step: cDNA synthesisOmdanning av mRNA til cDNA • Ulike kommersielle RT-enzymer • Omniscript RT-kit (Qiagen) • Kit from Roche: Master RNA Cybergreen • Superscript (Life Technol.) 1 oligo dT mRNA 2 5´ 3´ AAAAAAAAAAAAA 5´ 3´ cap 3 mRNA RT: Reverse transcriptase 4 5 6 7 mRNA 8 Templat for Real-time PCR cDNA

  12. Reaction mix for the LightCycler • Template DNA • cDNA from 50 ng total RNA, diluted 1:10 or 1:50 • Primers • 0.3-1.0 uM of each primer • MgCl2 • 1-5 mM • Nucleotides, Taq PCR buffer, Taq DNA Polymerase • Included in the LightCycler DNA Master SYBR Green I 1 2 3 4 5 6 7 8

  13. Samples to run • A series of dilutions are made to construct a standard curve for target gene • Using a subclone of the target • Sample (cDNA) with primers for target gene • In the form of cDNA made from the isolated RNA • Sample (cDNA) with primers for housekeeping genes for normalization purposes 1 2 3 4 5 6 7 8

  14. Standard curve • Use at least 3 concentrations for a standard curve • Use serial dilutions that are one order of magnitude apart _ 1:10, 1:100, 1:1000,... • For medium and high concentrations, a single point per concentration is sufficient 1 2 3 4 5 6 7 8

  15. Programming the Lightcycler 1 2 3 4 5 6 7 8

  16. Programming the Lightcycler • Preincubation • Denaturation • Amplification • Denaturation, annealing (primer dependent), elongation (bp/25 sec), cycle number (may be increased during run) • Melting curve • Primer dependent, 5-10 higher than the primer annealing temp • Cooling • Edit samples 1 2 3 4 5 6 7 8

  17. Optimization - an important step • Finding optimal MgCl2 • Find conc (1-5 mM) that gives best crossing point, signal intensity and slope • Annealing temperature? • Try to design primers with similar Tm, allows standard conditions of annealing temp • Controls - positive and negative • Always include a NTC (non template control, here water) to see primer-dimers • Also include a positive control to see that the reaction works 1 2 3 4 5 6 7 8

  18. Optimizing PCR conditions • Template dilution • Use dilution that gives crossing points in the 20-30 range • Programming • Annealing temp, elongation time • Improve your primer design? • If difficult to optimize, order new primers (much cheaper than long optimalization experiments) 1 2 3 4 5 6 7 8

  19. Interpretation of the results • Quantification by one or several standard curves • Ratio: target gene/housekeeping gene in each sample • Assumption: housekeeping gene expression = constant in the samples • Normalisation of the total cDNA using constitutively expressed housekeeping genes 1 2 3 4 5 6 7 8 Jurkat/Myb= 2.351 Jurkat/PP1 HeLa/Myb= 0.107 HeLa/PP1

  20. Interpretations of the results • Evaluation Parameters • Error < 1 • r = -1.00 • Slope • Melting curve analysis • Primer dimers • Expected melting point • Calculations 1 2 E = 10 -1/slope E = 10 -1/-3.407 = 1.97 3 4 5 6 7 8 Jurkat/Myb= 2.351 Jurkat/PP1 HeLa/Myb= 0.107 HeLa/PP1 22 fold

  21. Troubleshooting:Problem 1: primer dimers • Primer-dimers interferes with quantitation • LC with SYBR-green measures all DNA produced • Primer-dimer is a template-independent product that also produces fluorescence • Identifying primer-dimers: melting curve analysis • Pure, homogenous PCR products produce a single, sharply defined melting curve with a narrow peak. Primer dimers melt at relatively low temperatures and have broader peak 1 2 3 4 5 6 7 8

  22. How to avoid primer/dimers? • General approaches • Reduce delays in workflow • Optimize primers - may be more important with LC than in conventional PCR • Increase the annealing temperature Reduce annealing time to 1-5 sec. • Use hot start • inactive modified enzyme/Ab-bound enzyme that becomes activated after heat exposure • LC-specific approaches • Increase the temperature for fluorescence registration • Use of hybridization probes rather than SYBR-green • Reduce number of cycles, e.g. to 40. 1 2 3 4 5 6 7 8

  23. Problem 2: RNA contaminated with genomic DNA • Identify by running ± reverse transcriptase, compare Cps • Traces of genomic DNA will work as templates interfering with quantitation, may reduce reproducibility 1 2 3 4 5 6 7 8

  24. How to avoid problems with genomic DNA? • Always include a DNase I purification step in the RNA isolation procedure • Included in the kit used here • Always run a ±reverse transcriptase reaction to check the quality of the RNA • Used as the first experiment here 1 2 3 4 5 6 7 8

  25. Mandag Forsøk 1 • ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) Forsøk 2 • Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) • PP1 RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Forsøk 3 Real-time PCR • Test av celletype- spesifikk mRNA • c-myb Lightcycler Kvantitering av spesifikke mRNAs

  26. Tirsdag Forsøk 1 • ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) Forsøk 2 • Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) • PP1 RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Forsøk 3 Real-time PCR • Test av celletype- spesifikk mRNA • c-myb Lightcycler Kvantitering av spesifikke mRNAs

  27. Ulike mønstre av mRNA uttrykk • Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA • Noen er de samme i alle celler og blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener) • Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener). • I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse mRNA mRNA cDNA cDNA Kvantitering ReferanseUkjent

  28. Criteria for single standard curve • Equal Efficiency Required for Accurate Analysis • Prerequisite: EfficiencyStandard = EfficiencyTarget • Efficiency depends on: • - fragment length - advantage with short PCR-products (100-200 bp) • - intervening sequence • - spacing RT primer to PCR primer - advantage to design primers in the 3´-part of the gene

  29. Prerequisites of a suitable housekeeping gene • RNA-specific detection • pseudogene free • amplification / detection specific for active target • No regulation of expression level in the system analysed • normal vs. tumor tissue • unstimulated vs. stimulated cells • Similar expression level compared to the target analysed

  30. Gene Genomic structure / pseudogenes Regulation e.g. ß-actin multigene family; > 20 genes; 1 active locus : hormones of tyroid gland 20 pseudogenes : stomach tumor g-actin multigene family; pseudogenes GAPDH multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse : lung, pancreatic, colon cancer mostly pseudogenes : insulin, EGF 5.8S,18S, 28S RNA pseudogenes ß2-microglobulin no pseudogenes: Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumors G6PDH no pseudogenes : kidney, stomach tumor : hormones, oxidant stress, growth factors PBGD no pseudogenes aldolase pseudogenes HPRT pseudogenes U3, U8, ... Pseudogenes ornithin : tumors decarboxylase ... Housekeeping Genes

More Related