Analisi enzimatica
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 69

ANALISI ENZIMATICA PowerPoint PPT Presentation


  • 145 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

ANALISI ENZIMATICA. L’analisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni: determinazione dell’ attività catalitica di enzimi determinazione della concentrazione di sostanze per mezzo di enzimi

Download Presentation

ANALISI ENZIMATICA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Analisi enzimatica

ANALISI ENZIMATICA

L’analisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni:

  • determinazione dell’ attività catalitica di enzimi

  • determinazione della concentrazione di sostanze per mezzo di enzimi

  • determinazione della concentrazionedi sostanze mediante reattivi marcati con enzimi


Enzimi

ENZIMI

  • Gli enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica, con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze

  • Svolgono una funzione di catalizzatori (biologici), cioè accelerano le reazioni chimiche o fanno avvenire reazioni che altrimenti non avrebbero luogo

  • Sono caratterizzati da:

    • elevato potere catalitico

    • altissima specificità

E + S ES E + P


Enzimi1

Reazione catalizzata

DG*

Reazione non catalizzata

G

DG*

X

Y

DG

ENZIMI

  • Gli Enzimi differiscono dai catalizzatori chimici per:

    • Le velocità delle reazioni catalizzate da enzimi sono generalmente da 106 a 1012 più veloci di quelle non catalizzate.

    • Gli Enzimi catalizzano reazioni in condizioni relativamente blande, condizioni fisiologiche

    • Gli Enzimi spesso hanno un’elevata specificità verso substrati e prodotti.

    • L’attività degli Enzimi può essere regolata da altri fattori oltre che da substrato e prodotti.


Cofattori enzimatici

coenzima

gruppo prostetico

(legato covalentemente)

ione metallico

OLOENZIMA

COFATTORI ENZIMATICI

  • Oloproteine

  • l’attività dipende soltanto dalla struttura proteica

  • Eteroproteine:

  • l’attività richiede uno o più componenti non proteici, chiamati cofattori

  • Il cofattore può essere:

    • un coenzima (NAD+, NADP+, ADP, ATP)

    • un gruppo prostetico (FMN, FAD)

    • uno ione metallico (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+)

APOENZIMA

(Parte proteica)


Analisi enzimatica

COFATTORI

VITAMINE: precursori di coenzimi


Classificazione degli enzimi

CLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMI

  • Gli enzimi sono suddivisi in sei classi principali a seconda della natura generale delle reazioni catalizzate:

  • ossidoreduttasi

  • transferasi

  • idrolasi

  • liasi

  • isomerasi

  • ligasi

Ciascuna classe comprende delle sottoclassi, che a loro volta comprendono delle sotto-sottoclassi

  • Un enzima ha generalmente:

    • un nome comune

    • un nome sistematico

    • un numero di classificazione


Nomenclatura

NOMENCLATURA


Unit di misura

UNITÀ DI MISURA

  • Un enzima può essere misurato in termini di concentrazione come qualunque altra proteina

  • Da un punto di vista analitico interessa invece la misura dell’attività catalitica(o attività enzimatica)

  • L’attività enzimatica si esprime in Unità Internazionali (U.I.)

    Una unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima in grado di catalizzare la trasformazione di una micromole di substrato al minuto in condizioni standardizzate


Analisi enzimatica

G6125

Glucose  Oxidase Aspergillus nigerType II 15,000-25,000 units/g solid (without added oxygen)

Synonyms

b-D-Glucose: oxygen 1-oxidoreductase

GOx

G.Od.

CAS Number

9001-37-0

Enzyme Commission (EC) Number

1.1.3.4

EG/EC Number

EINECS

Properties

MDL number

MFCD00131182

References

Safety Information

Analysis Note

Protein determined by Biuret method.

Caution

Some loss of activity may occur after more than 3 days at room temperature. This product may be shipped with or without dry ice.

Linkage

This preparation is formulated from Type VII, G 2133, by addition of potassium gluconate.

Unit Definition

One unit will oxidize 1.0µmole ofb-D-glucose toD-gluconolactone and H2O2per min at pH 5.1 at 35° C, equivalent to an O2uptake of 22.4µl per min. If the reaction mixture is saturated with oxygen, the activity may increase by up to 100%.

storage temp.

-20°C

foreign activity

Catalase£2 Sigma units/mg solid

foreign activity

amylase, invertase and glycogenase, and maltase and galactose oxidase ~2 %

Merck

Merck13, 4473

Hazard Codes

Xn

Risk Statements

42

Safety Statements

22-45

RTECS

RQ8452000


Analisi enzimatica

P6782

Peroxidase horseradishType VI-A ~1000 units/mg solid (using ABTS) 250-330 units/mg solid (using pyrogallol) essentially salt-free, lyophilized powder

Synonyms

Horseradish peroxidase

Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase

CAS Number

9003-99-0

Enzyme Commission (EC) Number

1.11.1.7

EG/EC Number

2326686

MDL number

MFCD00071339

Description

Analysis Note

This product is assayed using ABTS for easy comparison to other suppliers'unit: approx. 1,000 units per mg solid

Linkage

Similar to P8375

Packaging

Packaged in mg solid

Unit Definition

One ABTS unit will oxidize 1µmole of ABTS per minute at 25°C at pH 5.0

Analysis Note

Using 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) tablets (Prod. No. A 9941) as substrate, approx. four times the activity is observed.

Analysis Note

The RZ ( Reinheitszahl) is the absorbance ratio A403/A275determined at 0.5-1.0 mg/ml in deionized water. It is a measure of hemin content, not enzymatic activity. Even preparations with high RZ may have low enzymatic activity.

Unit Definition

One unit will form 1.0 mg purpurogallin from pyrogallol in 20 sec at pH 6.0 at 20°C, unless otherwise indicated in the listing. This purpurogallin (20 sec) unit is equivalent to approx. 18µM units per min at 25°C.


Analisi enzimatica

C5421

Cholesterol Oxidase from Cellulomonas sp.buffered aqueous solution 20-60 units/mg protein (biuret)

Synonyms

Cholesterol: oxygen oxidoreductase

CAS Number

9028-76-6

Enzyme Commission (EC) Number

1.1.3.6

MDL number

MFCD00130783

Identifiers

Unit Definition

One unit will convert 1.0µmole of cholesterol to 4-cholesten-3-one per min at pH 7.5 at 25 °C. Note: 4-cholesten-3-one may undergo isomerization.

Physical form

Solution in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0

Description

storage temp.

-20°C

Properties

References

Literature

Smith, A.G. and Brooks, C.J.W.,Biochem. Soc. Trans. 5, 1088 (1977)


Analisi enzimatica

Glucose  Dehydrogenase Bacillus megateriumBioChemika ~33 units/mg

Synonyms

b-D-Glucose: NAD[P]+1-oxidoreductase

CAS Number

9028-53-9

Enzyme Commission (EC) Number

1.1.1.47

EG/EC Number

2328369

MDL number

MFCD00131181

Miscellaneous

NADH-regenerating enzyme. Valine manufacture from ketoisovalerate

Unit Definition

1 U corresponds to the amount of enzyme which will oxidize 1µmolb-D-glucose to D-glucono-d-lactone per minute at pH 7.6 and 25°C

mol wt

Mr~120000

storage temp.

-20°C

Literature

A. Honorat-Pascal et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 236 (1990)

49165

Identifiers

Description

Properties

References


Analisi enzimatica

ISOENZIMI

  • Gli enzimi non hanno una struttura omogenea

Isoenzimi: proteine che catalizzano la stessa reazione e presentano

diverse proprietà molecolari (diversa carica elettrica,

diversa solubilità, diversa resistenza ad agenti chimici e fisici) e/o diverse

proprietà funzionali presentano differenze in termini di pH ottimale,

affinità per substrato e coenzima…..

Es.

Isoenzimi della lattato deidrogenasi LDH:

LDH1 4 subunità H

LDH2 3 subunità H e da una M (H3M) (miocardio, eritrociti, rene e polmone)

LDH3 (H2M2) (milza, pancreas, tiroide, linfonodi)

LDH4 (HM3)

LDH5 (M4) (fegato e muscoli scheletrici)


Analisi enzimatica

METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI

METODI NON SELETTIVI

  • Metodi elettroforetici

  • Metodicromatografici

  • Metodi di elettrofocalizzazione


Analisi enzimatica

METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI

METODI SELETTIVI

  • Inibizione chimica

  • Ioni metallici, fluoruri, etanolo, solventi organici,…

  • Inibizione fisica

  • Determinazione degli isoenzimi della fosfatasi alcalina e

  • lattato deidrogenasi

  • Inibizione immunologica

  • Anticorpi

  • Reattività selettiva verso un substrato

  • Determinazione di LDH1


Infarto miocardico

Infarto miocardico


Diagnosi differenziale di infarto del miocardio e epatite acuta

ESEMPIO DI UTILIZZO DIAGNOSTICO DI ISOENZIMI

Diagnosi differenziale di infarto del miocardio e epatite acuta


Energia libera di attivazione

stato

di transizione

energia libera di attivazione della reazione inversa (non catalizzata)

energia libera di attivazione della reazione in avanti (non catalizzata)

energia libera di attivazione della reazione inversa (catalizzata)

energia libera

stato iniziale

cambiamento totale di energia libera durante la reazione

energia libera di attivazione della reazione in avanti (catalizzata)

stato finale

direzione della reazione

ENERGIA LIBERA DI ATTIVAZIONE

E + S ES E + P

  • L’energia libera di attivazione DG è la quantità di energia necessaria per portare tutte le molecole di 1 mole di una sostanza, ad una data temperatura, allo stato di transizione

  • Gli enzimi esercitano la loro attività catalitica abbassando l’energia libera di attivazione

  • Di conseguenza, in presenza di enzima sarà maggiore la concentrazione della specie allo stato di transizione

  • La velocità di reazione è proporzionale alla concentrazione della specie allo stato di transizione

  • Quindi, gli enzimi esercitano la loro attività catalitica aumentando la velocità delle reazioni chimiche


Attivit enzimatica

ATTIVITÀ ENZIMATICA

  • L’attività di un enzima viene misurata come velocità della reazione da esso catalizzata

  • La velocità di reazione viene misurata in termini di quantità di substrato trasformato, o di prodotto che si forma, nell’unità di tempo

  • La velocità delle reazioni chimiche è soggetta a leggi chimico-fisiche ben definite che consentono di ricavare delle equazioni della velocità diverse a seconda del tipo di reazione. Queste equazioni mettono in relazione la velocità di reazione con la concentrazione dei reagenti


Cinetica chimica

A P

A + B P

2 A P

CINETICA CHIMICA

  • Le reazioni chimiche vengono classificate su base cinetica per mezzo dell’ordine di reazione che indica come la velocità di reazione dipende dalla concentrazione dei reagenti

  • Reazioni di ordine 0

  • La velocità di reazione non dipende dalla concentrazione dei reagenti

  • Reazioni di 1° ordine

  • Reazioni di 2° ordine


Analisi enzimatica

A P

E

A P

velocità

[substrato]

CINETICA ENZIMATICA

  • In una reazione chimica non catalizzata la velocità di reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e il grafico velocità-concentrazione è una linea retta

  • In una reazione enzimatica la dipendenza della velocità di reazione dalla concentrazione del substrato non è costante, ma varia al variare della concentrazione del substrato stesso

  • Il grafico velocità-concentrazione è un’iperbole rettangolare, descritta da un’equazione del tipo

  • dove la velocità v e la concentrazione di substrato [s] sono le due variabili,

  • mentre V e Km sono due costanti

vmax


Equazione di michaelis menten

k1k2

E + S ES E + P

k-1

EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN

  • L’equazione vista in precedenza, che descrive la relazione velocità-concentrazione di substrato in una reazione enzimatica, è l’equazione di Michaelis-Menten

  • Come già detto, Vmax è la velocità dello stadio limitante della reazione enzimatica ad alte concentrazioni di substrato, quindi Vmax = k2[ES]

  • Ad alte concentrazioni di substrato l’enzima è saturato, perciò [ES] = [E], da cui Vmax = k2[E]

  • L’equazione può essere scritta in una forma diversa che evidenzia la dipendenza della velocità, oltre che dalla concentrazione di substrato, dalla concentrazione di enzima


Analisi enzimatica

CINETICA ENZIMATICA

3

1° ordine

2

[

s

]

×

×

[

E

]

[

s

]

V

[

s

]

>

>

=

v

=

k

max

K

2

m

K

K

m

m

1

  • Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato

  • Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni

Regione 1

La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S]

Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato


Analisi enzimatica

CINETICA ENZIMATICA

V

V

v

max

max

2

3

2

[

[

s

s

]

]

ordine 0

>

>

K

m

1

intermedie

ordine misto

=

=

v

[

E

]

V

k

max

2

Regione 2

Regione non utile dal punto di vista analitico

Regione 3

Regione analitica per la determinazione della attività enzimatica


Determinazione attivita enzimatica velocit iniziale

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

[P]

1

2

tempo

  • La misura di attivita’ enzimatica e’ una misura di velocita’ iniziale della reazione (v0) o (vi)

  • Vantaggi:

  • Si misura sicuramente la Vmax

  • L’enzima è in buone condizioni

  • Non ci sono problemi di inibizione da prodotto

  • Possibilità di distinguere tra attività enzimatiche diverse

  • Metodi analitici rapidi


Analisi enzimatica

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

Segnale analitico

(s/T) Approccio dispendioso in termini di tempo

Si utilizzano metodi ad un punto, a due punti, multipunto

s

t

tempo


Determinazione attivita enzimatica velocit iniziale1

[P]

tempo

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

  • Teoricamente sarebbe possibile misurare l’attività enzimatica anche nella fase di plateau, quando la velocità di reazione è nulla

  • Bisognerebbe misurare il tempo necessario per raggiungere il plateau

  • Maggiore è l’attività enzimatica, minore sarà il tempo necessario per raggiungerlo

  • Inconvenienti:

    • difficoltà di effettuare una misura accurata del tempo (elevato errore sulla misura)

    • tempi lunghi di esecuzione del metodo, in particolare per la misura di attività enzimatiche basse


Metodi ad un punto

METODI AD UN PUNTO

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

  • Si effettua una sola misura di segnale (ad es. assorbanza) ad un tempo prestabilito dopo l’inizio della reazione

  • Si risale all’attività enzimatica tramite una curva di calibrazione o un fattore di conversione

  • Affinchè la misura sia accurata:

    • il segnale al tempo 0 deve essere 0 oppure, se diverso da 0, deve essere costante e bisogna misurarlo (bianco della reazione) per poi sottrarlo

    • ci deve essere linearità di risposta dal tempo 0 al tempo x al quale viene eseguita la misura

segnale

Sx

tx

tempo

  • La condizione di linearità si verifica se la misura viene effettuata il prima possibile dopo l’inizio della reazione. In questo caso si misura una piccola variazione di segnale, che sarà accompagnata da un maggiore errore relativo


Metodi ad un punto1

METODI AD UN PUNTO

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

Approccio tecnico

Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi ad un punto

  • Metodi manuali e metodi automatizzati basati su analizzatori discreti automatici

    • Per effettuare la misura ad un tempo prestabilito la reazione enzimatica viene bloccata (variazione di pH o temperatura, aggiunta di un inibitore)

  • Metodi automatizzati basati su analizzatori a flusso continuo automatici

    • Campione e reagenti fluiscono attraverso un sistema di tubi mentre avviene la reazione e passano di fronte o attraverso il sistema di rivelazione. Il tempo al quale raggiungono il rivelatore viene definito regolando il flusso e la posizione del rivelatore lungo il sistema


Metodi a due punti

METODI A DUE PUNTI

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

Si effettuano due misure di segnale (ad es. assorbanza) a due tempi prestabiliti dopo l’inizio della reazione

Si potrebbero anche misurare i tempi necessari per raggiungere due valori prestabiliti di segnale, ma sarebbe più difficile automatizzare il sistema

Affinchè la misura sia accurata:

  • ci deve essere linearità di risposta tra i due tempi t1 e t2 ai quali viene eseguita la misura

segnale

S2

Questi metodi presentano il vantaggio di non richiedere la misura del bianco della reazione perché l’attività enzimatica viene calcolata come DS / Dt

S1

t1

t2

tempo


Metodi a due punti1

METODI A DUE PUNTI

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

Approccio tecnico

Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi a due punti

  • Metodi automatizzati basati su analizzatori discreti automatici

    • Ovviamente non si può bloccare la reazione al primo tempo di misura

    • A tempi prestabiliti vengono prelevate due aliquote di miscela di reazione in cui la reazione viene bloccata e si misura il segnale

  • Metodi automatizzati basati su analizzatori a flusso continuo automatici

    • La miscela di reazione fluisce attraverso due rivelatori posti ad una certa distanza fissa

    • Il flusso deve essere regolato accuratamente perché da esso dipendono i tempi ai quali vengono effettuate le misure


Analisi enzimatica

ENZIMI IN DIAGNOSTICA

  • Significato della presenza di enzimi intracellulari nel plasma

    • Aumento del turnover cellulare

    • Proliferazione cellulare (neoplasia)

    • Aumento di sintesi enzimatica (induzione)

    • Lesione di un tessuto

    • Ostruzione della secrezione

    • Diminuzione della eliminazione (clearance)

  • Concentrazione degli enzimi nel plasma dipende da:

  • sintesi dell’enzima

  • stato d’integrità delle membrane cellulari

  • fenomeni di distribuzione

  • velocità di eliminazione


Alcuni enzimi del plasma

Alcuni enzimi del plasma


Effetto del ph

colinesterasi

tripsina

attività enzimatica relativa

6

8

10

6

8

10

papaina

pepsina

4

6

8

2

4

6

pH

EFFETTO DEL pH

Il profilo a campana è il più comune


Effetto della temperatura

attività enzimatica relativa

20

40

60

T (°C)

EFFETTO DELLA TEMPERATURA

  • Gli enzimi hanno diversa stabilità termica

  • La parte discendente della curva è dovuta alla denaturazione termica


Misura di attivita enzimatica

E

S

P

MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA

DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALE

Reazioni enzimatiche semplici

  • Condizioni sperimentali

    • Substrato ed eventuali Cofattori in eccesso

    • pH e Temperatura controllati rigorosamente

    • Attenzione alla inibizione da substrato


Misura di attivita enzimatica1

Eprim.

Eind.

S

P1

P2

k1

k2

Eprim.

Eaus.

Eind.

S

P1

P3

P2

MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA

Reazioni enzimatiche accoppiate

  • Altre condizioni peculiari

  • La reazione primaria deve essere l’unico fattore limitante

  • Le reazioni indicatrici ed ausiliarie devono essere molto più veloci della reazione primaria, perché se P1 non viene rimosso rapidamente

    • può spostare il primo equilibrio verso sinistra e ritardare la reazione primaria

    • può seguire una via metabolica diversa

  • Per misure di almeno il 96% dell’attività enzimatica primaria k2 / k1≥ 100

  • Condizioni sperimentali

    • Substrato, eventuali Cofattori ed Enzimi indicatori ed ausiliari in eccesso

    • pH e Temperatura controllati rigorosamente


Determinazione enzimatica della concentrazione di analiti

DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI

  • Gli enzimi non sono l’oggetto dell’analisi, ma vengono utilizzati come “strumenti” analitici per determinare la concentrazione degli analiti di interesse con i seguenti vantaggi:

    • L’elevata specificità degli enzimi per i loro substrati consente spesso l’analisi diretta dei campioni biologici, senza o con poche e semplici fasi di estrazione e purificazione

    • L’elevato potere catalitico degli enzimi fa sì che i metodi enzimatici siano caratterizzati da bassi limiti di rivelazione, il che rende sufficienti volumi molto piccoli di campione

Maggiore rapidità

Maggiore accuratezza

Prelievo di piccoli volumi di fluidi biologici

Risparmio di reagenti


Analisi enzimatica

CINETICA ENZIMATICA

3

1° ordine

2

[

s

]

×

×

[

E

]

[

s

]

V

[

s

]

>

>

=

v

=

k

max

K

2

m

K

K

m

m

1

  • Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato

  • Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni

Regione 1

La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S]

Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato


Metodi a punto finale semplici

LDH

Eind.

Acido lattico + NAD+Acido piruvico + NADH + H+

S

P

METODI A PUNTO FINALE SEMPLICI

DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI

  • Per spostare la reazione dall’equilibrio e spostarla verso destra è necessario rimuovere i prodotti di reazione man mano che si formano

    • Accoppiamento con una seconda reazione enzimatica

    • Aggiunta di un reagente chimico che si leghi ai prodotti di reazione (idrazina)

  • Le condizioni sperimentali (enzima indicatore in eccesso, pH e T ottimali) non sono sufficienti per garantire che il substrato venga consumato completamente

  • Esempio: acido lattico


Metodi a punto finale accoppiati

Eaus.

Eind.

S

P1

P2

METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI

DETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI

  • Condizioni sperimentali

    • Enzimi indicatore ed ausiliario in eccesso

    • pH e Temperatura ottimali

  • La reazione indicatrice svolge anche la funzione di rimuovere continuamente i prodotti di reazione man mano che si formano, garantendo lo spostamento verso destra della reazione ed il consumo completo del substrato


Metodi di misura

METODI DI MISURA

  • La possibilità di “vedere” una reazione enzimatica è legata al fatto che i substrati e i prodotti hanno proprietà chimico-fisiche diverse

  • Tali proprietà devono poter essere misurabili

  • I metodi di rivelazione più comuni in enzimologia sono:

    • spettrofotometrici

    • luminometrici

  • Altri metodi sono:

  • potenziometrici, conduttometrici, polarografici

  • Ci sono, inoltre, metodi basati su enzimi immobilizzati


Metodi spettrofotometrici

METODI SPETTROFOTOMETRICI

I metodi spettrofotometrici sono quelli maggiormente utilizzati

e si basano su:

  • Misura diretta

  • Misura mediante derivati chimici

  • Misura mediante derivati generati enzimaticamente


Metodi spettrofotometrici1

METODI SPETTROFOTOMETRICI

  • Misura diretta

  • Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nel Vis (metodi colorimetrici)

    • Esempio:

      p-nitrofenilfosfato +H2O p-nitrofenolo + fosfato

      fosfatasi alcalina rivelata mediante il substrato cromogenico p-nitrofenilfosfato,

      idrolizzato enzimaticamente a p-nitrofenolo che in ambiente basico assorbe a

      405 nm (giallo)

  • Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nell’UV (gruppi ciclici e doppi legami)

    • Esempio: uricasi rivelata mediante l’assorbimento a 293 nm dell’acido urico che viene trasformato dall’enzima in allantoina

  • Inconvenienti della misura di assorbimento nell’UV:

    • lampada a idrogeno per generare l 200-300 nm

    • cuvette di quarzo costose

    • proteine ed acidi nucleici nel campione che assorbono nell’UV

AP


Metodi spettrofotometrici2

Assorbanza

Lunghezza d’onda (nm)

METODI SPETTROFOTOMETRICI

  • Misura diretta

  • L’attività enzimatica delle ossidoreduttasi che utilizzano (consumano o producono) NAD(P)H come cofattore può essere determinata direttamente perché il NAD(P)H ha un massimo di assorbimento caratteristico a 340 nm che non si trova nel cofattore in forma ossidata NAD(P)+

  • Il NAD(P)H può essere misurato anche in fluorescenza, con un massimo di eccitazione a 340 nm ed un massimo di emissione a 460 nm

    • Vantaggi: più basso limite di rivelazione teorico

    • Svantaggi: interferenze della matrice che producono un alto segnale di fondo


Metodi spettrofotometrici3

N

NR2

N

NR2

R2N

N

R3C

N+R1

R3C

N+

+ N

CR3

Cl-

2Cl-

Rx

Ry

N

N

N

Sale monotetrazolico

Sale ditetrazolico

R = gruppi aromatici

METODI SPETTROFOTOMETRICI

  • Misura mediante derivati chimici

  • Sali di tetrazolio

  • Composti cromogenici che vengono ridotti a formazani caratterizzati da valori elevati del coefficiente di assorbività molare e


Metodi spettrofotometrici4

Etanolo

NAD+

PMSH

Sale di tetrazolio

Acetaldeide

NADH + H+

PMS

Prodotto di riduzione (formazano)

METODI SPETTROFOTOMETRICI

  • Misura mediante derivati chimici

  • Sali di tetrazolio

  • Esempio: alcol deidrogenasi

Alcol deidrogenasi

PMS = fenazina metasolfato

  • Il valore di e dei formazani (e=20 m2/mol) è 2-4 volte più alto di quello del NAD(P)H (e=6.3 m2/mol) , perciò si ottengono limiti di rivelazione 2-3 volte più bassi (A = ebc)


Metodi spettrofotometrici5

X + NAD(P)H + H+ XH2 + NAD(P)+

YH2 + NAD(P)+ Y + NAD(P)H + H+

2-Oxoglutarato

Alanina

Lattato

NAD+

Glutammato

Piruvato

Piruvato

NADH + H+

ALT

LDH

METODI SPETTROFOTOMETRICI

  • Misura mediante derivati generati enzimaticamente

  • Accoppiamento con ossidoreduttasi

Esempio: alanina aminotrasferasi (ALT) mediante lattato deidrogenasi (LDH)


Metodi spettrofotometrici6

Glucosio

H2O + O2

Prodotto colorato o fotoni

Acido gluconico

H2O2

Accettore cromogenico o luminogenico

Glucosio ossidasi

Perossidasi

METODI SPETTROFOTOMETRICI

  • Misura mediante derivati generati enzimaticamente

  • Accoppiamento con perossidasi

Esempio: glucosio ossidasi


Metodi spettrofotometrici7

Fosfolipasi

Fosfatidilcolina + 2H2OAcido fosfatidico + Colina

Colina ossidasi

Colina + 2O2Betaina + 2H2O2

Perossidasi

2H2O2 + AccettoreProdotto colorato + 2H2O + O2

METODI SPETTROFOTOMETRICI

  • Misura mediante derivati generati enzimaticamente

  • Accoppiamento con perossidasi

Esempio: fosfolipasi


Aspetti quantitativi

ASPETTI QUANTITATIVI

Nel caso della concentrazione dell’analita nel campione tramite enzimi, nei metodi spettrofotometrici questa viene determinata mediante:

  • interpolazione del valore di segnale su una curva di calibrazione costruita con degli standard a concentrazione nota di analita

  • confronto con un’unico standard, attraverso la relazione

    derivante dalla legge di Lambert-Beer

  • Quando non si dispone di uno standard puro, la concentrazione dell’analita viene ricavata mediante il coefficiente di estinzione molare e del prodotto colorato, sfruttando la legge di Lambert-Beer


Aspetti quantitativi1

ASPETTI QUANTITATIVI

Perciò bisogna tenere conto del volume V della miscela di reazione e del volume v del campione:

Gli analizzatori automatici vengono programmati in modo da applicare funzioni che tengono conto di questi fattori


Metodi non spettrofotometrici

Ureasi

CO(NH2)2 + H2O2NH4+ + CO32-

Esempio

Glucosio ossidasi

glucosio + O2acido gluconico + H2O2

Esempio

METODI NON SPETTROFOTOMETRICI

  • Misure conduttimetriche

Utilizzo di elettrodo specifico per NH4+

  • Misure polarografiche

perossidasi

Utilizzo di elettrodo

selettivo per O2

derivatizzazione

chimica

accettore

prodotto colorato

È disponibile un analizzatore automatico commerciale per la determinazione del glucosio basato su questo principio


Metodi non spettrofotometrici1

Lipasi

triacilgliceroli + H2Odiacilgliceroli + monoacilgliceroli + ac. grassi- + H+

METODI NON SPETTROFOTOMETRICI

  • Misure potenziometriche

Esempio

Utilizzo di elettrodo per H+ (misura di pH)

  • Misure microcalorimetriche

Utilizzo di un termistore che consente di misurare le microvariazioni di calore che accompagnano le reazioni enzimatiche


Enzimi immobilizzati

ENZIMI IMMOBILIZZATI

Nel caso della determinazione della concentrazione di analiti mediante enzimi, gli enzimi possono essere immobilizzati su supporti insolubili quali cellulosa, polipeptidi, polimeri sintetici

  • Vantaggi

  • Possibilità di recuperare e riutilizzare gli enzimi al termine della reazione (riduzione dei costi)

  • Stabilità (risultati molto accurati e riproducibili)

  • Possibilità di automazione, ad esempio immobilizzando gli enzimi su gel di poliacrilammide e formando con esso delle colonne

  • Riproduzione più fedele della situazione che si verifica nelle cellule, specialmente per quegli enzimi che sono fissati su organuli cellulari


Enzimi immobilizzati su elettrodi

Ureasi

CO(NH2)2 + 2H2O + H+2NH4+ + HCO3-

Esempio

ENZIMI IMMOBILIZZATI SU ELETTRODI

Gli enzimi possono essere immobilizzati su un elettrodo specifico per il composto che viene modificato o prodotto nel corso della reazione enzimatica, ottenendo così un biosensore enzimatico

  • Un elettrodo specifico per gli ioni ammonio viene rivestito con un gel impregnato di ureasi

  • L’urea permea il gel dove viene idrolizzata dall’enzima formando ioni ammonio

  • In alternativa, un normale elettrodo per pH viene rivestito con un gel impregnato di ureasi e si misura il cambiamento di pH conseguente all’idrolisi enzimatica dell’urea


Principi di rivelazione

PRINCIPI DI RIVELAZIONE

  • Oltre ai principi di rivelazione convenzionali quali:

    • spettrofotometria

    • spettrofluorimetria

  • un altro principio di rivelazione si è affermato, in particolare nel settore dei metodi immunoenzimatici (utilizzo di reattivi marcati con enzimi):

    • chemiluminescenza


Analisi enzimatica

BIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZA

  • La luminescenza è l’emissione di radiazione elettromagnetica nell’UV, visibile o IR da parte di atomi o molecole come risultato della transizione da uno stato elettronicamente eccitato ad un livello energetico più basso, solitamente lo stato fondamentale

  • La chemiluminescenza (CL) è un fenomeno di luminescenza in cui l’energia per generare lo stato elettronicamente eccitato deriva da una reazione chimica

  • La bioluminescenza (BL) è un fenomeno di chemiluminescenza nel visibile che si verifica in organismi viventi


Analisi enzimatica

Substrato CL

Diretta

Indiretta

[Prodotto]*

+ Accettore

Prodotto + [Accettore]*

Prodotto + hn

Accettore + hn

SISTEMI CHEMILUMINESCENTI

  • Sono stati definiti due tipi principali di reazioni CL: dirette ed indirette

  • Le reazioni indirette sono dette CL a trasferimento di energia


Analisi enzimatica

NH2

NH2

O

+ N2 +H2O+ hn

COO-

perossidasi

NH

H2O2/OH-

NH

COO-

O

luminolo

aminoftalato

SISTEMI CHEMILUMINESCENTI

Luminolo/H2O2/Perossidasi


Analisi enzimatica

O

O

O

O

fosfatasi alcalina

O

C

H

O

C

H

3

3

-

OPO32-

O

-

A

M

P

D

A

M

P

P

D

HPO42-

O

*

O

C

H

3

-

O

O

+

F

+

O

C

H

3

-

O

O

*

h

n

F

+

F

+

SISTEMI CHEMILUMINESCENTI

1,2-Diossietani-fenil-fosfato/Fosfatasi alcalina


Analisi enzimatica

O

O

O

C

H

O

O

3

O

C

H

b

3

-galattosidasi

H

O

O

H

O

H

O

O

O

-

o

O

H

*

O

C

H

O

C

H

3

3

O

O

O

+

+

h

n

-

-

o

o

SISTEMI CHEMILUMINESCENTI

1,2-Diossietani-fenil-b-D-galattopiranoside/b-Galattosidasi


Analisi enzimatica

A

M

luciferasi

luciferina + ATP + O2 ossiluciferina + CO2 + AMP + P~P + luce

Mg2+

O

C

O

O

H

H

O

H

O

luciferasi

N

N

S

S

pirofosfato

H

luce

+

P

+

+

+

A

T

P

S

S

N

N

O

,

M

g

2

+

2

luciferina

n. fotoni emessi

FBL/CL =

n. molecole reagenti

SISTEMI BIOLUMINESCENTI

  • Luciferina/luciferasi da lucciola, in particolare da Photinus pyralis (lucciola nord-americana)

  • L’efficienza quantica F di questa reazione è vicina a 1


Analisi enzimatica

ossidoreduttasi

NAD(P)H + H+ + FMN NAD(P)+ + FMNH2

FMNH2 + R-CHO + O2 FMN + R-COOH + H2O + luce

luciferasi

luciferasi batterica

C

H

(

C

H

)

C

H

O

+

F

M

N

H

C

H

(

C

H

)

C

O

O

H

+

F

M

N

+

luce

3

2

1

2

2

3

2

1

2

O

luciferina batterica

2

SISTEMI BIOLUMINESCENTI

  • Luciferina/luciferasi da diverse specie di batteri marini quali Vibrio fischeri, V. harvei, Photobacterium phosphoreum

  • Il sistema batterico luciferina/luciferasi in vivo è accoppiato ad una ossidoreduttasi che produce FMNH2


Analisi enzimatica

ASPETTI QUANTITATIVI e CARATTERISTICHE ANALITICHE

Aspetti quantitativi:

  • La maggior parte delle reazioni BL e CL coinvolge enzimi

  • In presenza di un eccesso di substrato l’intensità del segnale luminoso è proporzionale all’attività enzimatica

  • Al contrario, in presenza di un eccesso di enzima l’intensità dell’emissione luminosa è proporzionale alla concentrazione di substrato

  • La bio- e chemiluminescenza rappresentano quindi un principio di rivelazione adatto all’analisi quantitativa

Caratteristiche analitiche:

  • Rivelabilità superiore a quella delle reazioni colorimetriche e comparabile a quella dei radioisotopi

  • Minimo segnale di fondo dovuto alla matrice biologica rispetto alla fluorescenza

  • Ampio intervallo dinamico

  • Rapidità di risposta

  • Costi ridotti e minori rischi rispetto all’uso di marcatori radioattivi


Applicazioni analitiche

colesterolo ossidasi

colesterolo H2O2

fosfolipasi D colina ossidasi

fosfolipidi colina H2O2

perossidasi

luminolo aminoftalato + N2 + H2O + hn

H2O2/OH-

APPLICAZIONI ANALITICHE

Luminolo/H2O2/Perossidasi

  • Determinazione dell’attività della perossidasi endogena in fluidi biologici, omogenati di tessuto, ..

  • Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono ossidasi ed il sistema H2O2/H2O


Analisi enzimatica

APPLICAZIONI ANALITICHE

Luciferina/Luciferasi da lucciola

  • Determinazione della concentrazione di ATP ed altri nucleotidi adeninici in campioni biologici

  • Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono chinasi e la formazione o degradazione di ATP

creatinina creatina

creatina + ATP creatina-fosfato + ADP

ATP + luciferina + O2 AMP + P~P + CO2 + ossiluciferina + hn

creatinina ammide idrolasi

creatina chinasi

luciferasi

Mg++


Analisi enzimatica

APPLICAZIONI ANALITICHE

Luciferina/Luciferasi batterica

  • Determinazione della concentrazione di NADH e NADPH, con maggiore sensibilità per il NADH (fmoli)

  • Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono deidrogenasi e la formazione o degradazione di NAD(P)H

R-OH + NAD+ R=O + NADH

NADH + H+ + FMN NAD+ + FMNH2

FMNH2 + R-CHO + O2 FMN + R-COOH + H2O + hn

7a-idrossisteroide-deidrogenasi

ossidoreduttasi

luciferasi


Analisi enzimatica

APPLICAZIONI COMMERCIALI

Rapid Enzymatic Tests for Glucose

Introduction:

Reagent strips have been designed to perform rapid and semi-quantitative analysis for glucose. They are easy to use and require no addition laboratory equipment of reagents. Three reagent strips, Clinistix, Dextrostix and Diastix, will be used. The enzymatic reactions involved are as described below.

Step 1:

Glucose -----------Glucose Oxidase --------Glucose ----------------------- > Gluconic Acid + H2O2

Step 2: Clinistix and Dextrostix:----------H2O2 + chromogen orthotolidine- Peroxidase --------H2O2 + chromogen orthotolidine ------------- > oxidized orhotolidine

--------Diastix:--------H2O2 + Potassium iodide ---Peroxidase --------H2O2 + Potassium iodide ------------------ > iodine complex

The intensity of the color gives a semi-quantitative analysis of the level of glucose in the samples.

Materials:Please refer to class notes and p. 82-82b of the Laboratory Manual  .   Bottles of Reagent Strips

Instead of blood and urine samples, Sample Solutions A, B, and C will be used

Procedure:

Clinistix: 

· Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 10 seconds, compare to colour chart provided

Dextrostix: 

· Add a drop of sample solution to the test strip · After exactly 60 seconds, wash with water for 2 second (water bottle) · Blot once gently · Compare to colour chart immediately

Diastix: 

· Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 30 seconds, compare to colour chart


  • Login