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第二十一章

第二十一章. 基因诊断与基因治疗 Genetic Diagnosis and Gene Therapy. 基因变异致病类型. 内源基因的变异 基因结构突变 基因表达异常. 外源基因的入侵. 第一节 基因诊断. 概念和特点 基因诊断的常用技术方法 基因诊断的应用. 一、基因诊断的概念和特点 概念 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。. 特点. 针对性强 特异性高 灵敏度高 适用性强，诊断范围广. 二、基因诊断的常用技术方法. 核酸分子杂交技术

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第二十一章

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Presentation Transcript

  1. 第二十一章 基因诊断与基因治疗 Genetic Diagnosis and Gene Therapy

  2. 基因变异致病类型 • 内源基因的变异 • 基因结构突变 • 基因表达异常 外源基因的入侵

  3. 第一节 基因诊断 • 概念和特点 • 基因诊断的常用技术方法 • 基因诊断的应用

  4. 一、基因诊断的概念和特点 概念 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。

  5. 特点 • 针对性强 • 特异性高 • 灵敏度高 • 适用性强，诊断范围广

  6. 二、基因诊断的常用技术方法 • 核酸分子杂交技术 1.限制性内切酶酶谱分析法 2.DNA限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析 3.等位基因特异寡核苷酸探针（allele specific oligonucleotide，ASO）杂交法 • 聚合酶链反应（PCR） • 基因测序 • 基因芯片

  7. （一）核酸分子杂交技术 • 来源不同、具有互补碱基序列的核酸（DNA或RNA）单链在适宜条件下互补配对形成杂化双链结构。 • 选用已知顺序片段作为探针，经放射性同位素或非放射性物质标记后，再与未知的目的核酸链进行杂交反应。 • 分离已杂交和未杂交的标记核酸片段，通过标记信号的检测对未知的目的核酸链进行定性、定量分析。

  8. 5´ 3´ 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 MstⅡ酶切位点(GCTNAGG) 5´ 3´ 正常基因 1.15kb × 突变基因 1.35kb

  9. ﹣ + 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 1.35kb 1.15kb 0.2kb 正常人 突变携带着 患者

  10. RLFP分析法

  11. 3.等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide, ASO)杂交法 • 当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成ASO用同位素或非同位素标记进行诊断。 • 探针通常为长20bp左右的核苷酸。 • 用于探测点突变时一般需要合成两种探针，一种是野生型探针，与无突变序列互补杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种是突变型探针，只与突变基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.

  12. ASO杂交法 正常 ASO A A T C 基因型: +/+ +/- -/- 杂交: ++++ ++ 突变 ASO G G C T 基因型: +/+ +/- -/- 杂交: ++ ++++

  13. （二）聚合酶链反应（PCR） • 直接采用PCR技术进行基因诊断； • 常与其它技术如分子杂交、限制酶酶谱分析、单链构象多态性检测、限制性片段长度多态性分析、DNA序列测定等联合应用。 • PCR-RFLP • PCR-SSCP

  14. PCR/单链构象多态性分析 • (single strand conformation polymorphism, SSCP) • PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。

  15. ﹣ + 纯合突变 杂合突变 正常人 Leber 病患者 PCR/SSCP分析

  16. （三）基因测序 • 基因测序是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法； • 可确定突变的部位和性质； • 由于技术原因，目前尚难以直接在临床上应用。

  17. DNA诊断：以DNA为检测对象，探测DNA序列中的突变情况；DNA诊断：以DNA为检测对象，探测DNA序列中的突变情况； RNA诊断：以mRNA为检测对象的诊断方法；常用的有RNA点杂交、Northern分析和定量逆转录PCR等。

  18. （四）基因芯片 • 近年来兴起的基因分析与检测的新技术，具有快速、敏感、高效、平行化、自动化等优点，将发展成新一代基因诊断技术； • 可检测基因的结构及其突变、多态性，分析基因的表达情况； • 按照基因芯片的用途将其分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片等。

  19. 三、基因诊断的应用 • 遗传疾病 • 肿瘤 • 感染性疾病，传染性流行病 • 判断个体疾病易感性 • 器官移植组织配型 • 法医学中个体识别、亲子鉴定

  20. 第二节 基因治疗 • 概念和方法 • 基因治疗的基本程序 • 基因治疗的应用与展望

  21. 一、基因治疗的概念 • 定义 • 早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。 目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。

  22. 基因治疗的方法 • 基因矫正 (gene correction) • 基因置换 (gene replacement) • 基因增补 (gene augmentation) • 基因失活 (gene inactivation)

  23. 几种常见的基因失活技术 • 反义核酸技术 • 核酶技术 • 三链技术 • 干扰RNA(RNAi)技术 基因治疗的其他方法：如“自杀基因”的应用，基因疫苗等

  24. 自杀基因可产生细胞自杀效应 • 将“自杀基因”转移入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀效应”，从而达到清除肿瘤细胞的目的。

  25. 二、基因治疗的基本程序 治疗性基因的选择 基因载体的选择 病毒载体 非病毒载体 靶细胞的选择 体细胞 生殖细胞 基因转移 间接体内疗法 直接体内疗法 外源基因表达的筛选利用在体中的标记基因 回输体内

  26. 间接体内疗法 直接体内疗法

  27. 优点: • 高效转导 • 基因高表达 • 较大外源DNA的包装 • 缺点: • 可能瞬时转染 • 不能针对特异细胞 • 病毒吸收普遍存在 • 安全性

  28. 三、基因治疗的应用与展望 应用 遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病 展望 进一步寻找切实有效的基因 精密调控外源基因在人体内的表达 体细胞移植和重建的生物学研究 减少外源基因对机体的不利影响

  29. 研究现状与应用 • 用正常的基因校正有缺陷的基因本身，以治疗遗传性疾病（三大类：单基因疾病、多基因性疾病、获得性疾病、与基因改变有关的感染和一些肿瘤） • 目前仅限于体细胞，基因型的改变只限于某一类体细胞且只限某个体的当代。

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