1 / 24

RNA-interferens

RNA-interferens. «Junk DNA». Human genome project 1,5 % av genomet koder for proteiner Hva med resten? Ikke-kodende? Søppel? Genregulering Epigenetisk regulering. Cytoplasma. RNA. Det finnes store mengder RNA som ikke translateres videre til proteiner: Ribosomalt RNA Transfer-RNA

rocco
Download Presentation

RNA-interferens

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. RNA-interferens

  2. «Junk DNA» • Human genomeproject • 1,5 % av genomet koder for proteiner • Hva med resten? Ikke-kodende? Søppel? • Genregulering • Epigenetisk regulering

  3. Cytoplasma

  4. RNA • Det finnes store mengder RNA som ikke translateres videre til proteiner: • Ribosomalt RNA • Transfer-RNA • Ribozymer • InterferendeRNA-molekyler • Sistnevnte har vært kjent siden 70-tallet, men har vært avfeid som små degradasjonsprodukter

  5. RNA-interferens • siRNA (små interfererende RNA) • Mikro-RNA • Mellomformer

  6. siRNA • Antatt fylogenetisk eldst. Forsvar mot virus eller andre innkommende genetisk elementer. • Antatt å være viktigst for leddyr, nematoder, planter og sopp • Oftest eksternt dobbelttrådet RNA (viralt RNA) som kuttes opp • 21-25 bp med to overhengende baser i hver ende • 100% match med målsekvens – fører til destruksjon av mål-RNA • Innkommende RNA blir brukt som våpen mot «seg selv»

  7. siRNA • «Primitivt» immunsystem • Spesifikt forsvar mot infeksiøse agens • Hukommelse?

  8. Mikro-RNA • Reguleringsmolekyl som dannes av cellen selv • Foldet struktur med hårnål-former som kuttes opp • Ikke nødvendigvis 100% match med målsekvens (hyppigst 100% hos planter, sjelden hos pattedyr • 19-23 bp, med 2 overhengende baser i hver ende • Antatt å være viktigst hos planter og mennesker • Utgjør 2-3% av det humane genom, og antas å være involvet i regulering av ca 30% av humane gener.

  9. Oppdagelsen • Petunia • Tilførsel av pigmentgen med kraftig promotor ga uventet effekt: Førte til at mange planter delvis mistet fargen helt. Både tilført gen og plantens eget ble inaktivert. Kalt ko-suppresjon (Napoli 1990)

  10. Oppdagelsen forts. • Caenorhabditiselegans • (Fire 1998). RNA hadde da blitt sirklet inn som sannsynlig substrat. Fire gjorde de avgjørende forsøkende på C. elegans og påviste at korte komplementære dsRNA-fragmenter var tilstrekkelig for å gi tilsvarende effekt på proteinsyntesen hos denne organismen. • Mange viktige oppdagelser siden har vært gjort under forsøk med C. elegans.

  11. RNAi-apparatet • Dicer • RISC • Argonaut (subenheten som står for kuttingen i RISC)

  12. Mikro-RNA

  13. siRNA

  14. Unntakene • Endogene siRNA (av gener med mange repetitive regioner) • involvert i kromatinregulering • ExogenemiRNA • Flere DNA-virus (F.eks. CMV) koder for miRNA-molekyler som kan hemme cellens antivirale respons) • shRNA • Bioteknologisk løsning der man lager små RNA-molekyler som danner én enkelt hairpinsom kan fungere som siRNA. Dannes ved transkripsjon av f.eks. plasmid i målcellen.

  15. Anvendelse • Forskningsverktøy • Gen-knockdown i cellekulturer • Syntetiske dsRNA med ønsket spesifisitet • Plasmider eller virus (retrovirus, AAV) som vektor • Behandling: • Virale infeksjoner • Kreft • Degenerative sykdommer

  16. Virale infeksjoner • RSV • Knockdown av RSV’s N-protein (nukleoprotein) • siRNA tilført med nesespray • Fase 2-studie (DeVincenzo 2010) • 88 pasienter, randomisert, dobbeltblind • 38% reduksjon i antall dyrkningsbekreftede RSV-infeksjoner (p=0,009)

  17. Virale infeksjoner • Hepatitt C • En rekke in vitro-forsøk har vist meget god effekt • Levering av molekylet til leveren er en utfordring • Bæremolekyler (lipider, apolipoprotein m.m.) • På forsøksstadiet • microRNA-122 (miR-122) er viktig for HCV-translasjon (uviss mekanisme) • Helsyntetiske nukleinsyresekvenser (LNA) er benyttet på sjimpanser med HCV-infeksjon. Ga markant virus-suppresjon. • Fase 1-studie på mennesker på gang

  18. Cancer • Cancer pancreatis • Knockdown av KRAS-genet med siRNA tilført i biodegraderbarepolymerer. Injisert direkte i tumoren. Fase 2-studie på gang • Familiær tykktarmspolypose • Knockdown av beta-kateninmed siRNA produsert av rekombinant E.coli tilført peroralt. • Gode resultater i dyreforsøk. Fase 1 på gang.

  19. Nevrodegenerative sykdommer • Huntingtons sykdom • Knockdown av htt (huntingtonproteinet) • Museforsøk. shRNA-gen satt inn i adenoassosiert virus. • Injisert IV • Signifikant symtomreduksjon og reduksjon av patologiske lesjoner i hjerne.

  20. Fordeler • Små doser – få bivirkninger • Lett å designe og produsere • Spesifikk effekt

  21. Utfordringer • RNA-levering til målorgan • Nukleaser i vev • Immunaktivering (via TLR) • Off target effects • Escape-mutasjoner • Levertoksisitet i høye doser

  22. Oppsummering

  23. CRISPR • Lignende system hos bakterier • Utgangspunktet er her DNA-molekyler • Forsvar mot bateriofager eller plasmider • Biter av innkommende DNA blir brukt som våpen mot andre identiske sekvenser • Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats (CRISPR)

More Related