Организационные вопросы лабораторий молекулярно-биол...
Download
1 / 61

Организационные вопросы лабораторий молекулярно-биологических исследований - PowerPoint PPT Presentation


  • 333 Views
  • Uploaded on

Организационные вопросы лабораторий молекулярно-биологических исследований. Куевда Д.А., Шипулин Г.А. ФГУН «Центральный НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора. Правила GLP ( Good Laboratory Practice). Условия получения качественных результатов анализа.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' Организационные вопросы лабораторий молекулярно-биологических исследований' - river


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

Организационные вопросы лабораторий молекулярно-биологических исследований

Куевда Д.А., Шипулин Г.А.

ФГУН «Центральный НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора


Правила лабораторий молекулярно-биологических исследованийGLP

(Good Laboratory Practice)


Условия получения качественных результатов анализа

  • A valid methodology – валидированная методология = «хорошие» тест-системы + соответвующее оборудование + правила работы (СОПы)

  • A quality assurance systems – «хорошая» лаборатория .

  • Trained and experienced analysts – обученный и опытный персонал.

  • A quality control system - система контроля качества.


Актуальные направления молекулярной диагностики ВИЧ-инфекции

  • Раннее выявление инфицированных детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей -ДНК ВИЧ(выявление)

  • Выявление инфицированных лиц в период «серологического окна», в т.ч. тестирование донорской крови РНК ВИЧ(выявление)

  • Мониторинг терапии РНК ВИЧ(вирусная нагрузка)


Новые молекулярной диагностики ВИЧ-инфекциинаправления молекулярной диагностики ВИЧ-инфекции

  • Определение устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам - РНК ВИЧ(секвенирование)

  • Определение генетической предрасположенности к непереносимости антиретровирусных препаратов – ДНК человека (выявление специфичных участков)

    Гиперчувствительность к Абакавиру – аллель hla B5701


Этапы проведения исследования молекулярно-биологическими методами

Сбор

Транспорт и хранение

Пробопод-готовка

ОТ и амплификация (ПЦР)

Детекция

Интерпретация результатов

ТЕСТ-СИСТЕМЫ

ОБОРУДОВАНИЕ

МЕТОДОЛОГИЯ, ПРАВИЛА РАБОТЫ, СОПы

ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРИИ

ПЕРСОНАЛ

N.B! Тонкие места анализа


Тонкие места анализа молекулярно-биологическими методами. Сбор, транспортировка и хранение

  • Для выявления и определения вирусной нагрузки ДНК HBV, РНК HCV и РНК ВИЧ используется только плазма крови (с ЭДТА, не сыворотка!)

  • Для определения мутаций устойчивости ВИЧ используется только плазма крови

  • Для выявления ДНК ВИЧ используютсяцельная кровь, лейкоциты крови (не плазма!)

  • Для выявления генетических предрасположенностей используютсяцельная кровь, лейкоциты крови

    Создание лабораторных регламентов и правил

    Работа с контрагентами лаборатории, обучение


Тонкие места анализа: тест-системы(пробоподготовка+ амплификация + детекция)

  • Следование инструкции к тест-системе

  • Соблюдение условий транспортирования и хранения

  • Сроки годности реагентов

  • Смешивание реагентов различных серий (?)

  • налаживание контроля и учета реагентов, система электронного документирования


Тонкие места анализа: оборудование

  • Вспомогательное оборудование (вортексы, центрифуги, термостаты, отсасыватели)

    • Весомый вклад в качество результата

    • Часто отсутствуют или ненадлежащего качества

  • Работа в ламинарных боксах (нарушение правил)

  • Отсутствие необходимого основного оборудования (e.gгельдокументирующая система)

  • Работа с персональным компьютером, «Интернет»

  • Владение английским языком

  • Экспертные консультации, обучение

  • Тщательный подбор персонала


Качество используемого оборудования

Удовлетворительный прибор

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ образцы – «засветка» с соседнего канала флуоресценции, риск ложноположи-тельного ответа

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ образцы

Неудовлетворит-ый прибор

Рез-ты iQ5, BioRad

Тщательный подбор оборудования

Апробации перед приобретением


Открытые или закрытые системы оборудования

  • Идеальное решение: открытое оборудование с клинически адаптированным программным обеспечением, позволяющим как выдавать формализованные результаты, так и самостоятельно произвести экспертную оценку (пересмотр) данных – должно быть разработано(!)


Сравнение цен оборудования


Тонкие места анализа: интерпретация результатов

  • Необходимость экспертных знаний для оценки результатов в том числе в случае использования закрытых систем с автоматической интерпретацией

  • Основные «болевые точки»:

    • Оценка данных ПЦР в реальном времени (определение вирусной нагрузки)

    • Оценка и редактирование последовательностей после секвенирования (определение мутаций устойчивости ВИЧ в АРВП)


Интерпретация результатов. Требования к точности количественных методов

  • Отличие измеряемой величины от истинной не более чем +/- 0,5 десятичных логарифма (lg) или в 3,2 разасчитается удовлетворительным

  • N.B! Логарифмконцентрации – показатель степени, в которую необходимо возвести 10, чтобы получить значение концентрации

    lg(1000) = 3 т.е. 103 = 1000, 100,5 = 3,2

  • Все молекулярные методы логарифмические, то есть все расчеты (в т.ч. статистические) проводятся в логарифмах и лишь затем пересчитываются в значения концентраций


Интерпретация результатов Требования к точности количественных методовгенотипирования

  • чтение и редактирование полученной нуклеотидной последовательностив соответствие с рядом правил

  • умение работать с международными базами данных генотипов и фенотипов («виртуальное фенотипирование») (Stanford, Los-Alamos) через сеть «Интернет»

  • Проблемы:

    • Отсутствие знаний, навыков

    • Сложность обеспечения доступа в «Интернет»

    • Языковой барьер

    • Отсутствие системных данных о вариантах резистентности, присутсвующих на территории РФ


Проект российского он-лайн ресурса по резистентности ВИЧ к АРВП

Задачи проекта:

  • Сбор оперативной информации о циркулирующих геновариантах ВИЧ в контексте устойчивости АРВП

  • Поиск новых мутаций устойчивости ВИЧ исходя из данных, полученных на территории РФ

  • Облегчение работы по интерпретации результатов

  • Внешний контроль качества


Документация ресурса по резистентности ВИЧ к АРВП:ПравилаGLP

Правила=Стандартные Операционные Процедуры


Документация ресурса по резистентности ВИЧ к АРВП: для чего нужны СОП?

Стандартные Операционные Процедуры (СОП) описываютвдеталяхвсе рутинные операции в лаборатории. Они необходимы в качестве дополнения к инструкции, если вы хотите, чтобы результаты исследований воспроизводились.В большинстве случаев СОПы содержат ответы на следующие вопросы:• Кто выполняет анализ?• Какой анализ выполняется?• При каких условия анализ может быть выполнен?• Где выполняется анализ?• Как анализ должен быть выполнен?


Условия получения качественных результатов анализа

  • A valid methodology – валидированная методология = «хорошие» тест-системы + правила их применеия + СОПы

  • A quality assurance systems – «хорошая» лаборатория .

  • Trained and experienced analysts – обученный и опытный персонал.

  • A quality control system - система контроля качества.


Действующий документ результатов анализа

1.3. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ПРИ ИССЛЕДОВАНИЯХ

МЕТОДОМ ПЦР МАТЕРИАЛА,

ИНФИЦИРОВАННОГО МИКРООРГАНИЗМАМИ

I-II ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУ 1.3.1794 – 03

Издание официальное

Москва, 2003


Проект результатов анализа,2009

1.3. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИЙ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ МЕТОДЫ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИЛОТ ПРИ РАБОТЕ С МАТЕРИАЛОМ, СОДЕРЖАЩИМ МИКРООРГАНИЗМЫ

I-IVГРУПП ПАТОГЕННОСТИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Москва, 2009


Требования к организации работ результатов анализа

  • 4.1 Исследование материала методами амплификации… связано с необходимостью одновременного обеспечения и соблюдения правил биологической безопасности и требований к организации и проведению данных работ с целью предотвращения контаминации нуклеиновыми кислотами исследуемых проб, помещений и оборудования/

  • 4.3 Противоэпидемический режим в соответствие с СП 1.3.1285-03 (I-II группы патогенности) и/или СП1.3.2322-08 (III-IV группы патогенности)


Специальные требования результатов анализак организации ПЦР-лаборатории связаны с механизмом ПЦР


ПОЛИМЕРАЗНАЯ результатов анализа

ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ


Контаминация продуктами амплификации – одна из главных проблем

ПЦР-лаборатории !


Причина контаминации – попадание продуктов амплификации в окружающую среду при открывании пробирок после амплификации.


Следствие контаминации попадание продуктов амплификации в окружающую среду при открывании пробирок после амплификации– появление артефактов ДНК диагностики


Факторы, способствующие контаминации ПЦР-лаборатории

  • Использование методов детекции ПЦР-продуктов, включающих открывание амплификационной пробирки (секвенирование, электрофорез)

  • Неправильная организация ПЦР-лаборатории.

  • Неправильное поведение лабораторного персонала.


Основные контаминации принципы организации ПЦР-лаборатории

  • Разделение лаборатории на 4 рабочих зоны:

    • I. Прием, маркировка, регистрация материала, первичная подготовка, аликвотирование

    • II. Очистка нуклеиновых кислот

    • III .Подготовка смесей и проведение ОТ и амплификации

    • IV. Детекция

  • Полное исключение физического сообщения между 4-й и 1,2,3 –й зонами (персонал не перемещается между зонами!)

  • Активные мероприятия, направленные на выявление контаминации и ее устранение.


План лаборатории молекулярной диагностикииспользующей МАНК с электрофоретической и ГИФА детекцией продуктов

Зона 4. детекция

Вспомогательные помещения

Зона 1. регистрация, первичная обработка

Зона 2. выделение НК

Зона 3. Амплификация


Технология амплификации в реальном времени и контаминация

  • Пробирки с продуктами реакции не открываются –риск контаминации резко снижен

  • НО! Риск контаминации сохраняется в связи с наличием вероятности случайного открывания пробирки после реакции, следовательно:

    • Желательна отдельная комната для амплифкации

    • Постоянный контроль лабораторной контаминации


План лаборатории молекулярной диагностикииспользующей МАНК с флуоресцентной детекцией

Зона 3а. Подготовка смесей

Зона 3b. Амплификация

Вспомогательные помещения

Зона 1. регистрация, первичная обработка

Зона 2. выделение НК


Требования к лаборатории, проводящей секвенирование(оределениерезистентности ВИЧ к АРВП)

  • Проведение секвенирования – работа со сверхконцентрированными образцами ДНК (ампликонами) – должна проводиться в зоне 4

  • Реакция секвенирования чувствительна к загрязнениям и примесям

    • В пределах 4 зоны для постановки реакции должна быть выделена отдельная комната (зона 4b)

    • Постановка реакции секвенирования должна осуществляться в ламинарном шкафу 2 класса


План лаборатории молекулярной диагностикииспользующей МАНК с ЭФ, ГИФА детекцией продуктов и проведением секвенирования

Зона 4а. Детекция ЭФ, ГИФА

Зона 4b. чипы, секвенирование,

Вспомогательные помещения

Зона 1. регистрация, первичная обработка

Зона 2. выделение НК

Зона 3. Амплификация


+ + + диагностики

Приточно-вытяжная вентиляция

должна быть устроена отдельно

для I, II, III идля IVзоны

Пре-ПЦР

ПЦР

Пост-ПЦР

-

-

-

-

коридор

Для удаления пыли эффективно использование принудительной фильтрации воздуха через

HEPA-фильтры.


Мероприятия, направленные на выявление контаминации – смывы в лаборатории (п. 8.10)

  • Позволяют выявить факт контаминации лаборатории до появления ложно-положительных результатов, провести контроль деконтаминации

  • Периодичность: 1-4 раза в месяц, после деконтаминации

  • Случаи контаминации регистрируют в спец. журнале

  • Правила:

    • смоченный в ТЕ-буфере ватный зонд проводится по рабочим поверхностям лаборатории (10-15 секунд)

    • Зонд погружается в 400 мкл ТЕ-буфера, отжимается и выбрасывается, суспензию центрифугируют

    • Полученный раствор исследуют методом ПЦР с внутренним контролем


Система обеспечения качества выявление контаминации –

  • Мониторинг условий сбора, хранения, транспортировки, предобработки клинического материала, постановки ПЦР и реакции секвенирования

  • Качество работы оборудования (в первую очередь амплификаторов).


Прибор для поверки точности поддержания температурного режима амплификаторов - СМТ-8

  • Точность ± 0.1 °С

  • Количество каналов - 8

  • Измерение в реальном времени

  • Пробирки - 0.2 ml and 0.5 ml


Результаты измерения температуры исправного амплификатора


Результаты измерения температуры неисправного амплификатора


Iq5 biorad
Результаты температуры неисправного амплификации при неверной настройке прибора для ПЦР в реальном времени (iQ5, BioRad)

«Инвертированные» кривые - ?


Условия получения качественных результатов анализа

  • A valid methodology – валидированная методология = «хорошие» тест-системы + правила их применеия + СОПы

  • A quality assurance systems – «хорошая» лаборатория .

  • Trained and experienced analysts – обученный и опытный персонал.

  • A quality control system - система контроля качества.


Задачи обучения персонала лаборатории

  • Получение знаний о принципах, лежащих в основе молекулярных методов диагностики

  • Знакомство с практическим применением молекулярных методов в клинической практике

  • Обучение практическим навыкам работы в лаборатории молекулярных методов

  • Обучение экспертной оценке данных


Снижает ли использование «закрытых» систем требования к обучению персонала?

Результаты ФСВОК, цикл вирусная нагрузка ВИЧ, 2008 год:

  • Неудовлетворительные результаты – 25%

  • Лаборатории использующие «закрытые» системы – 26%

  • Лаборатории, использующие «открытые» системы – 23%


Лицензия на право образовательной деятельности ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора


Аудитории учебного образовательной деятельности ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» центра ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора

Лаборатория

Лекционный зал


Практическая работа образовательной деятельности ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» (80 часов)


Первый цикл обучения методу образовательной деятельности ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» секвенирования для выявления мутаций устойчивости ВИЧ к АРВП

  • Осень 2009

  • 2 недели - базовый курс

  • 1 неделя – спец.курс по методу секвенирования

  • Открыт сбор заявок


Условия получения качественных результатов анализа

  • A valid methodology – валидированная методология = «хорошие» тест-системы + правила их применеия + СОПы

  • A quality assurance systems – «хорошая» лаборатория .

  • Trained and experienced analysts – обученный и опытный персонал.

  • A quality control system - система контроля качества.


A quality control system
Система контроля качества результатов анализа(a quality control system)


Этапы внутреннего контроля результатов анализаПЦР-лаборатории

  • Выборочный экспертный пересмотр кривых флуоресценции(Real-time PCR), электрофореграмми сиквенсограмм

  • Слежение за качеством прохождения контрольных точек

  • Регулярное использование шифрованных аттестованных образцов (контрольных панелей) – не реже 1 раза в квартал (п. 9 МУ «Контроль качества проводимых исследований»).

  • Внутрилабораторные смывына контаминацию (п. 8.10 МУ)


Преимущества внешней оценки качества (ВОК) лаборатории

  • Максимально объективный анализ работы лаборатории

  • Привлечение к осуществлению ВОК ведущих специалистов (по методологии контроля качества аналитических систем, основам теории ошибок, метрологии и статистике);

  • Возможность корректной аттестации контрольных образцов и получение референтных значений;

  • Получение статистически достоверных данных по сравнительной характеристике качества разных наборов реактивов, стандартных образцов и т.д.


Федеральная система внешней оценки качества лабораторных исследований -ФСВОК

Циклы в 2009 году:

  • ВИЧ - вирусная нагрузка

  • HCV – качественно и вирусная нагрузка

  • HBV – качественно и вирусная нагрузка

    Пилотный проект (Федеральный Центр СПИД и ФСВОК):

  • Определение мутаций устойчивости ВИЧ к АРВП

г. Москва. 101953

Петроверигский пер., 10,

Тел./факс: (495)923-69-27


www.qcmd.org оценки качества лабораторных исследований -


Валидация метода оценки качества лабораторных исследований -

Обученный персонал

  • Экспертное заключение

  • Выбор тест-системы

  • Внедрение тест-системы

  • Непрерывное обучение

  • Соответствие анализа целям диагностического исследования

  • Оценка аналитических проблем

  • Определение критических мест анализа

  • Описание ограничений, времени, стоимости, трудоемкости

  • Определение характеристик анализа

КАЧЕСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ АНАЛИЗА

  • Алгоритмы интерпретации данных

  • Описание действий при возникновении ошибок

  • Описание действий при возникновении ошибок

  • Непрерывное обучение

  • Валидация тест-системы на референс-образцах

  • Документация на обучение

  • Материальное обеспечение теста

  • Дизайн лаборатории

  • Калибровка оборудования

  • Протоколы СОП

  • Документация

  • Качественные расходные материалы и оборудование

  • Условия забора и хранения

  • Референс материалы

  • Внутренний контроль деятельности

  • Внешний контроль деятельности

QA

QC

Обеспечение качества/

контроль качества

Условия получения качественных результатов анализа


Благодарю за внимание оценки качества лабораторных исследований -


ad