Volné radikály a antioxidanty

1. Volné radikály a antioxidanty Dvě základní rovnováhy • acidobazická – předávání protonu • zásada + H+↔ kyselina • oxidačně-redukční – předávání elektronu • oxidovaná forma + e-↔ redukovaná forma

2. Charakteristika radikálu radikál – částice s nepárovým elektronem ve valenční sféře radikálová reakce – složitý průběh, halogenace alkanů • iniciace • propagace • terminace

3. Reaktivní formy kyslíku = reactive oxygen species - ROS • superoxid O2 + e- =O2·- • peroxid vodíku O2·-+ e- + 2H+ = H2O2 • hydroxylový radikál H2O2 + e- = OH- + HO· • voda HO· + e- = OH-

4. Reaktivní formy dusíku = reactive nitrogen species - RNS • oxid dusnatý arginin + O2 = NO· + citrulin • oxid dusičitý 2 NO· + O2 = 2 NO2· • peroxynitrit NO·+ O2·-= OONO-

5. Zdroje volných radikálů ROS a RNS v organismu Enzymové zdroje superoxidu • membránově vázané enzymy s koenzymy: chinoidy, flaviny, hem, Cu 1. Respirační řetězec mitochondrií • 1-4% O2 redukováno neúplně na ROS • komplex I (NADH – ubichinonreduktáza) • komplex III (ubichinol: cytochrom c- reduktáza)

6. 2. Cytochrom P-450 v endoplazmatickém retikulu • ROS vázané na enzym – biotransformace, oxidace ethanolu 3. Specializované buňky – leukocyty, makrofágy • NADPH – oxidáza v cytoplazmatické membráně – baktericidní ochranný systém • myeloperoxidáza – produkce HClO 4. Oxidace hemoglobinu na methemoglobin

7. Neenzymové zdroje ROS • chinonová antibiotika • adriamycin, daunomycin, streptonigrin, ... • pyridiniové herbicidy • paraquat, diquat – poškození plic • nízkomolekulární komplexy Fes fosfáty, nukleotidy • komplexy s ATP, ADP

8. Zdroje oxidu dusnatého - NO· • z terminálního atomu N argininu v přítomnosti O2 • reakce katalyzovány syntázami oxidu dusnatého – NOS • NOS I – mozková • NOS II – makrofágová • NOS III - endotelová

9. NO· O2 + NADPH

10. Fyziologické funkce volných radikálů Volné radikály jsou nástrojem oxidáz a oxygenáz • dýchací řetězec • vnitřní mitochondriální membrána • aerobní fosforylace • biotransformace xenobiotic • cytochromoxidasa v mitochondriích – P450 • superoxid a peroxid vázány na enzym • syntetické pochody v buňce • monooxygenasy v endoplazmatickém retikulu jater nebo mitochondriích nadledvin • hydroxylace xenobiotik, syntéza cholesterolu a žlučových kysyselin

11. ROS a RNS účinná zbraň fagocytů proti bakteriím • leucyty a makrofágy • syntéza superoxidu NADPH-oxidázou obsaženou v cytoplazmatické membráně • baktericidní ochranný systém • polymorfonukleáry • myeloperoxidáza – syntéza HClO z H2O2 a Cl- • syntetáza NO (NOS II) • koncentrace NO vzroste o několik řádů • syntéza peroxynitritu - NO + superoxid – OONO-

12. ROS a RNS jako signální molekuly • informační síť • primární posel, sekundární posel • proteinkinázy – ovlivnění aktivity enzymu, exprese genu • citlivost informační sítě závisí na redoxním stavu buňky (ovlivnění proteinkináz) • redoxní stav • kapacita antioxidačního systému (dostupnost redukčních ekvivalentů) • intenzita oxidační zátěže (RONS) • oxid dusnatý NO • druhý posel • neurotransmiter v CNS a autonomním nervstvu • vazodilatace cév

13. Antioxidační ochranný systém • omezení tvorby nadměrného množství ROS a RNS • regulace aktivity enzymů • vychytání tranzitních prvků z reaktivních míst • zachycení a odstranění vzniklých radikálů • vychytávače, lapače, zhášeče • enzymy, látky tvořící s radikály stálejší produkty • obecné reparační mechanismy poškozených makromolekul • fosfolipázy • reparační enzymy DNA • proteolýza oxidačně poškozených proteinů

14. Enzymové antioxidační systémy H2O + ½ O2 kataláza SOD + Fe2+ O2·- H2O2 ·OH + Fe3+ + OH- 2 GSH NADPH+H+ GSHPx 2 H2O GSSG NADP+

15. Superoxiddizmutáza – SOD • v každé buňce • zrychluje dizmutaci superoxidu o 4 řády Typy superoxiddizmutázy • superoxiddizmutáza 1 - (SOD1) též Cu, Zn – SOD • dimer, v každé podjednotce atom Cu a Zn • v cytosolu a mezimembránovém prostoru mitochondrií • superoxiddizmutáza 2 - (SOD2) též Mn – SOD • tetramer, u prokaryont a v mitochondriální matrix • extracelulární superoxiddizmutáza (EC – SOD) • tetramer, obsahuje Cu a Zn

16. Glutathionperoxidázy • odstranění intracelulárních hydroperoxidů • selenoproteiny – selonocystein v aktivním centru Katalyzuje reakci: • 2 GSH + ROOH = GSSH + H2O + ROH Typy glutathionperoxidáz • cytosolová GSH – glutathionperoxidáza (cGPx) • rozkládá hydroperoxidy mastných kyselin po uvolnění z lipidů, H2O2 • fosfolipidhydroperoxid-GSH-peroxidáza (PHGPx) • redukuje fosfolipidové hydroperoxidy přímo v plazmatické membráně bez uvolnění mastných kyselin z fosfolipidů

17. Kataláza - KAT Katalyzuje dvouelektronovou dizmutaci peroxidu vodíku: • 2 H2O2↔ 2 H2O + O2 Význam: • inaktivace H2O2 v peroxizómech a mitochondrii hepatocytu, cytoplasma erytrocytu

18. Vysokomolekulární endogenní antioxidanty Proteiny vážící volné Fe a Cu = inaktivace tranzitních kovů • transferin – váže Fe3+ v plazmě • feritin – intracelulární, má ferooxidázovou aktivitu, zásobárna Fe v buňce • haptoglobin – vychytává extracelulární hemoglobin • ceruloplazmin – v plazmě váže Cu • albuminy – váží –SH skupinami Cu • metalothioneiny – váží ionty kovů v jádře

19. Nízkomolekulární endogenní antioxidanty Kyselina askorbová – vitamin C • redukuje radikály – O2·-, HOO·, HO·, ROO·, NO2 • přechází na hydroaskorbát (askorbylový radikál) – málo reaktivní • regenerace redukcí NADH nebo dizmutuje na askorbát a dehydroaskorbát • redukuje Fe3+ na Fe2+ • vstřebávání Fe ve střevě • využití Fe v aktivním centru hydroxyláz • s Fe působí prooxidačně

20. Kyselina askorbová HO· + H2O α-tokoferol (vitamín E) R-O-O· + R-O-O-H

21. a – tokoferol a vitamin E • vitamin E – skupina 8 izomerů – biologicky nejvýznamnější a-tokoferol • antioxidant biologických membrán • redukuje alkylperoxylové radikály LOO· lipidů na hydroperoxidy – ty poté redukovány glutathionperoxidázou • přechází na málo reaktivní tokoferylový radikál • regenerace askorbátem

22. Ubichinon/ubichinol – koenzym Q • benzochinony s izoprenovým řetězcem – nejrozšířenější CoQ10 • součást dýchacího řetězce v mitochondriích • vyskytuje se ve všech membránách – s tokoferolem tlumí radikálové reakce Karotenoidy, b-karoten a vitamin A • chemicky izoprenoidy • odstraňují radikály centrované na uhlík a LOO· v lipidech

23. 2e- + 2H+ R-O-O· +

24. Thioly a disulfidy – Glutathion GSH • tripeptid- g-glutamylcysteinylglycin • nejvýznamnější intracelulárni redoxní pufr • 2 GSH = GSSG + 2H+ + 2e- Význam: • neenzymově odstraňuje ROS – HO·, RO·, ROO· • udržuje v redukované formě –SH skupiny proteinů, cysteinu, CoA, regeneruje askorbát • substrát glutathionperoxidáz

25. 2 - 2e- - 2H+ + 2e- + 2H+

26. Kyselina lipoová • kofaktorem pyruvátdehydrogenázy a a-ketoglutarátdehydrogenázového komplexu • antioxidant ROO·, askorbylového radikálu, HO·, NO·, O2·- Kyselina močová • konečný produkt odbourávání purinů • nejdůležitější antioxidant plazmy • vychytává RO·, HClO, váže Fe a Cu Další- bilirubin, flavonoidy, melatonin ...

27. Kyselina lipoová 2e- + 2H+ Kyselina močová - Urát H + + R · + RH

28. Prolomení antioxidační ochrany • oxidační stres – porušení rovnováhy mezi vznikem a odstraňováním ROS a RNS • nadměrná produkce radikálů • nedostatečná antioxidační ochrana • příčiny nadměrné produkce ROS a RNS • reoxygenace tkáně po ischemii • po příjmu oxidoredukčně aktivních xenobiotik • uvolněním Fe a Cu z vazeb na zásobní proteiny • nadměrná produkce NO a překročení kapacity SOD NO + O2·- = peroxynitrit - silný oxidant

29. Klíčová úloha Fe při oxidačním poškození organismu • Fentonova reakce Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + HO· + OH- • katalytická schopnost Fe v aktivních centrech enzymů – substrát vybrán ku prospěchu organismu • Fe takto reaguje i při nespecifické vazbě na proteiny, lipidy, NK – po úniku z transferinu a feritinu – poškození molekul • lidské tělo – 4 gramy Fe • v oxidoreduktázách nepatrná část • 70% v hemoglobinu, 10% v myoglobinu

30. Peroxidace lipidů - LPO • in vitro – žluknutí olejů – autooxidační radikálová reakce • in vivo– peroxidace lipidů -polyenové mastné kyseliny • neenzymová • vyvolána nespecifickými patologickými faktory • štěpení MK na uhlovodíky – ethan, pentan a aldehydy • snížení fluidity membrán • enzymová • hydroperoxydázami – produkce biologicky aktivních prostaglandinů

31. lipid - H2O HO· alkylový radikál O2 peroxylový radikál Fe alkoxylový radikál C2H6 alkan alkenal

32. Poškození proteinů • oxidace aminokyselinových zbytků • methionin – methioninoxid • cystein – kys. cysteinová • arginin – aldehyd kys.glutamové • prolin – kys.glutamová • hydroxylace AMK • aromatické AMK • produkty lipoperoxidace • vazba na –NH2 lyzinu - agregace • poškození –NH2 skupin v místech vazby na Fe

33. Poškození DNA • reakce s HO· • vyjmutí H z deoxyribózy – přerušení řetězce • adice s bázemi – hydroxy- a oxoderiváty