6. 生物监测技术

1. 6. 生物监测技术 崔兆杰 2004.6

2. 6. 生物监测技术 • 生物监测技术是用生物评价技术和方法对环境中某一生物系统的质量和状况进行测定，它可以弥补理化监测不足，配合物理化学监测，或者成为综合的环境监测手段 • 特点： • 生物监测所反映的是自然的和综合的污染状况 • 生物可以选择性地富集某些污染物可以作为早期污染的报警器。 • 可以监测污染效应的发展动态 • 内容： • 生物群落监测法 • 生物残毒监测 • 细菌学监测 • 急性毒性试验 • 致突变物监测

3. 6.1 水体污染生物群落监测技术 • 水体污染的生物群落监测即为水污染生态学监测，主要是根据浮游生物在不同污染带中出现的物种频率或相对数量或通过数学计算所得出的简单指数值来作为水污染程度的指标的监测方法 • 污水生物体系法 • 生物指数法(BI) • 水生植物法

4. 6.1.1 污水生物体系法 • 根据在污染水体中生物种类的存在与否，划分污水生物体系，确定不同污染程度水体中的指示生物。反之，根据水体中的指示生物的存在亦可确定水体污染程度，又称柯克维茨(Kolkwitz)和麦尔松(Marsson)体系法 • 当一河流被污染后．在其下游相当长的流积内，水体发牛一系列自净过程，一方面污染程度逐渐降低，同时出现持有的指示生物 • 形成几个连续污染带：多污带、α—中污带、β中污带和寡污带等四级

5. 6.1.1 污水生物体系法 1. 多污带 • 多污带也称多污水域，是多污水生物生存的地带 • 它多处在污水、废水入口处，其水高度浑浊，多呈暗灰色，具有强烈的硫化氢臭味，并含有大量的有机物 • 多污带生化需氧量很高，而溶解氧趋于零，其细菌数量大、种类多，每升水中细菌数目达百万个以上，甚至达数亿个 • 多污带指示生物有浮游球衣细茵、贝氏硫细菌、李衣藻、颤蚯蚓、钟形虫等等。

6. 6.1.1 污水生物体系法 2. 中污带 (1)α—中污带水质呈灰色，近于多污带，水体除还原作用外．已出现氧化作用，如底泥中的硫化铁部分被氧化生成氢氧化铁。蓝藻、绿藻等已有生成，原生动物的太阳虫、吸管虫等已出现，且贝藻类等少数软体动物亦可在此生存。此带的指示生物有大颤藻、小额藻、小球淡、臂尾水软虫等等。 (2)β--中污带中氧化作用已占优势、绿色植物大量出现，溶解氧增加，硅藻、绿藻等大量出现，细菌数量显著减少，双鞭毛虫类、贝类、各种昆虫大量出现，已有色类。此带的指示生物有水生束丝藻，变异直链硅藻、蚤状水蚤、大型水蚤、帆口虫、巨环旋轮虫等等

7. 6.1.1 污水生物体系法 3. 寡污带 • 寡污带又称贫污带，此带已完成自净作用，有机物已被氧化或矿化，溶解氧近饱和生物需氧量小于3mg/L，浑浊度低，水细菌数量极少 • 寡污带生物学特征是有大量显化植物生存，各种昆虫和鱼类种类较多

8. 6.1.2 生物指数(BI)法 1. 培克法 • 培克(Beck)于1955年首先提出以生物指数来评价水体污染的程度 • 他按两栖大型无脊椎动物对有机污染的敏感和耐性分成两类，并规定在环境条件相近似的河段，采集—定面的底栖动物，进行种类鉴定

9. 6.1.2 生物指数(BI)法 2. 津田松苗法 • 津田松苗(日)从60年代起多次对培克生物指数作了修改，他提出不限定采集面积，出4—5人在一个点上采集30min，尽量把河段各种大型底栖动物采集完全，然后对所得生物样进行鉴定、分类，并采用与上述相同方法计算

10. 6.1.2 生物指数(BI)法 3. 多样性指数 • 多样性指数的特点是定量反映群落结构的种类、数量及群落中类种组成比例变化的信息 • 应用多样性指数虽能定量地反映群落结构，但不能反映个体生态学信息及各类生物的生理特性，也不能反映由于水中营养盐类的变化，可能引起的群落的改变等等

11. 6.1.3 水生生物法 • 藻类对重金属浓缩、富集规律： 1．污染区植物体中重金属含量高于非污染区。 2．河口区植物体中重金属含量高于其他区。 3．河流、湖泊底质中重金属含量高，则植物体中的重金属含量高。 4．不同类型水生植物对重金属的吸收积累能力为：沉水植物＞飘浮、浮叶植物＞挺水植物 5．重金属在水生植物体中的含量：根部大于茎、叶部位 • 利用水生植物进行生物学评价时，需要首先确定评价标准。然后布点，采样，进行监测，最后经统计评价，划分水质等级

12. 6.1.3 水生生物法 1. 浮游藻类监测法 • 浮游藻类的监测主要是对硅藻种类比例统计 • 样品的前处理 • 一般样品要经浓缩，并经蒸馏水清洗，最后浓缩至5ml，然后吸取均匀混合样均匀覆盖一整片清洗过的盖片，蒸发至干。经最后一次蒸发至干，将盖片放在载片的中央(样品面朝上)，在300一500℃电热板上灼烧(载片在下)20一45min。冷却后即可封固

13. 6.1.3 水生生物法 • 封片 • 先置一点封片胶(Hyrax胶)干清洗的载片上，将上述灼烷过的盖片盖上(样品面朝下)，在90℃左右加热去除溶剂，然后降低温度，在封片胶不沸腾时，用两根火柴棒同时向两边轻轻压挤盖片，让多余的胶溢出四周，使封注尽可能的薄。冷却后，用单面刀片刮去溢出的胶(刮下的胶不可再度封注)，即可进行镜检 • 计数及计算 • 硅藻的分类计数在10×l0倍(至少在900×)油镜下进行。通常用测微尺按长条计数法分类计数至少250个硅藻，用划“正”的方法记录每种的个体数n1,n2除以计数的硅藻总个体数Σn1，再乘100％，即得每种硅藻的百分比。原水样每毫升中任何一种硅藻的个体数等干原水样每毫升中硅藻总数(活细胞数加空壳数)乘以该种硅藻百分比

14. 6.1.3 水生生物法 2. 浮游动物监测法 • 活体观察与记录 • 原生动物和轮虫的分类，应进行活体观察(在现场或回实验室)并应作好记录 • 样品的浓缩 • 一般采用沉淀—倾泻法 • 镜检计数及计算 • 浮游动物的计数采用1ml计数框，计数方法同浮游植物，结果为每毫升原水样中含原生动物个数

15. 6.1.3 水生生物法 3. 底栖动物监测法 • 监测的原则和方法 • 当见软体动物和水栖寡毛类可以鉴别到种，颤蚓类需要观察成熟的生殖器官，故需要制片在显微镜下观察，由低倍到高倍，一般用甘油做透明剂，鉴定完毕即可将标本放回原瓶，以便计数 • 水生昆虫除摇蚊科幼虫外，皆可在解剖镜下鉴定到届，在低倍镜下确定目、科，高倍镜下对照资料鉴定到属，摇蚊科幼虫主要依据口器的结构差异来定属、种 • 计数和结果表达 • 将每个采样站的底栖动物种类及其数量(个体数)进行准确、系统的统计。用采泥器取样，推算出每平方米数量，包括每种的数量和总量 • 将每个采样站的底栖动物种类(先列水生昆虫，再列软体动物、水栖寡毛类及其它)统计数量填人表

16. 6.2 植物空气污染监测技术 • 空气是生物赖以生存的条件，当空气受到污染时，某些植物就会有不同程度的反映。利用植物对空气污染的异常反映可以监测空气污染的种类和含量，这就是植物空气污染监测 • 植物受空气污染物的伤害一般分为两类：受高浓度污染物的侵袭时，短期内即在叶片上出现坏死伤斑，称为急性伤害；长期与低浓度污染物接触时，因长期受阻、发育不良，出现失绿早衰的现象称为慢性伤害 • 植物的抗性分类： • 抗性强的植物 • 抗性中等的植物 • 敏感性植物

17. 氟化物污染的指示植物 • 当氟的积累量超过一定限度的浓度时，就使叶子遭受伤害，被伤害组织和正常组织之间的区带呈现明显的褐色特征。在一般情况下，叶尖和叶边缘(尤其是前叶边缘)最先受害，变成灰白色或褐色。在叶脉间也形成类似二氧化硫伤害所出现的斑点 • 作为氯化物污染的指示植物有唐菖蒲、郁金香、葡萄、雪松等，它们对氟化物都很敏感 • 氮氧化物和免化剂的指示植物 • 氯氧化物的指示植物有烟草、菠菜、豆类和番茄等 • 对光化烟雾敏感的植物有烟草、菠菜、大麦、燕麦、甜菜、牵牛花、番茄、秋海棠、蔷薇等

18. 6.2.2 植物群落监测法 • 在一定地段的自然环境条件下，由一定的植物种类结合在一起，成为一个有规律的组合，每一个这样的组合单位叫做一个植物群落，群落中的植物与植物间、植物与环境间彼此依存、互相制约，存在着复杂的相互关系 • 空气污染的情况下，植物群落中各种植物由于它们对污染质敏感性的差异，其反应有着明显的不同。因此、分析植物群落中各种植物的反应，利用植物及其群落光合速率和呼吸速率的测定，可以估测该地区的空气污染程度

19. 6.2.2 植物群落监测法 • 测定仪器及原理 • 在植物进行光合作用时测得的光合作用是总光合作用和呼吸(暗呼吸和光呼吸]作用之差，即净光合速率 • 植物光合速率和植物的呼吸速率现在常用红外线气体分析仪或光合作用测定仪测定

20. 6.2.2 植物群落监测法 • CO2定量系统 • 红外线CO2分析仪 • 红外线气体分析仪的设计原理是由异原子组成的双原子气体分子对红外光的吸收 • 红外线气体测定法分为升路法和闭路法 • 红外线CO2测定仪有台式和便携式两类 • 除湿装置：干燥塔。 • 除尘过滤器：陶瓷过滤器、过滤嘴。 • 零气装置：零气指不含CO2的气体，通常用纯N气钢瓶或碱石灰或碱石棉管作零气装置

21. 6.2.2 植物群落监测法 • 同化箱系统 • 同化箱： • 由活动支架和透明薄膜套组成其大小尺寸按被测定植物而有相应的变化。 • 空气调节器

22. 6.2.2 植物群落监测法 • 气路系统 (1)各种规格的塑料管道(以无色 透明或白色为宜)。 (2)流量测定装置；电风速仪、转 子流量计。 (3)气体动力设备：气泵、鼓风机 • 4．附属设备 (1 ) 光合测定车。 (2)电源装置，发电机组。 (3)测定生态因子的仪器：辐射仪(或光量子仪)，温度计，湿度计，土壤水分测定仪。 (4)叶面积仪。 (5)精密天平(感量：1／1000g)

23. 6.2.2 植物群落监测法 2. 草地和农田群落的测定 • 该法可直接用于低矮植物群落，如草地、农田群落等的测定，也可用于测定森林乔木冠层。 • 植物群落的光台速率和呼吸速率可分别用单位时间单位群落(地)面积内所有植物的光台速率和呼吸速率来表示，单位为μmol／(m2·s) • 为排除土壤呼吸对测定结果的干扰，可在同化箱覆盖的地面裸地上铺上塑料布，以尽量减少上壤呼吸过程中释放的CO2。或者，测定土壤呼吸

24. 6.2.2 植物群落监测法 • 测定 • 测定前，对红外线气体分析仪进行预热、标定，并记录标定时的气压和温度。同时安装测定系统。将选定佯地的植株罩于相应大小的同化箱内 • 测定时，首先调整零点。接通测定系统，并根据测定需要调节同化箱内的有关环境因子。待仪器读数稳定后，记录CO2浓度数值和相应的同化箱内的气体流量和温度、湿度，以及空气温度、湿度、 CO2浓度和光照强度

25. 6.2.2 植物群落监测法 • 结果计算 • 作物群落净光合速率的计算 • 其一时间段其一样本的净光合速率计算

26. 6.2.2 植物群落监测法 • 群落净光合速率的计算

27. 6.2.2 植物群落监测法 • 群落呼吸速率的计算 • 各时间段呼吸速率计算

28. 6.2.2 植物群落监测法 • 群落呼吸速率的计算

29. 6.2.2 植物群落监测法 3. 森林群落的测定 • 森林群落的光合速率常通过分别测定其乔木层、灌木层和草本层的光合速率后求和而得到。相应地，它的呼吸速率是通过分别测定其乔木层、灌木层和草本层的呼吸速率后求得 • 测定的点应尽可能分布在林内不同的高度和树干的不同方向上，并且照顾到不同叶龄的叶片。先作好如下工作： (1)样点的选择：在待测森林群落的每一样地内的每个种类选择健壮正常立木若干。每株至少选五个样本(即不同高度、主杆的不同方向、不同发育阶段)，每个样点可以用一片叶(阔叶树)或一个枝(如针叶树等)来代表 (2)样地的描述：将样地的基本特征包括森林的名称，种类成分，生长阶段等作比较详细的记录。 (3)测定时刻环境因子描述：每次测定需首先将环境因子包括光照强度、日照时间温度、湿度、风速与风向等都记录在预制的表格中

30. 6.2.2 植物群落监测法 • 1．森林群落的净光台速率的测定 • (1)将选定样点的样枝或样叶置于同化室(箱)内，用便携式或台式、单或多通道红外CO2测定仪测定各个样本同化箱出气口的CO2浓度(C2),在每次测定前需首先测定空气中的CO2浓度(C1) • (2)乔木层叶面积求算:测定森林群落的叶面积指数的通常做法是选择样枝，通过叶面积和重量的相关性测定样枝的叶面积，从而估算整株和整个乔木层的叶面积指数 • (3)乔木层的净光合速率的计算公式如下： • (4)森林群落净光台速率的计算

31. 6.2.2 植物群落监测法 • 森林群落呼吸速率的测定 • (1)灌草本层呼吸速率的测定：同草地和农田群落呼吸速率的测定。 • (2)乔木层呼吸速率的测定：白天在每次每样本光合速率测定完后，需立即测定一次呼吸作用。白天呼吸速率的测定是在同化箱外罩一块黑红布，目的是使测试样品脱离光源，而在晚上则无需布罩 • (3)群落呼吸速率的计算:利用各个时间段内的呼吸速率Rj，可以计算群落的平均呼吸速率(R)

32. 6.3 细菌检验监测技术 • 细菌总数法是细菌学检验法的一种主要方法。它是指1mL水样在营养琼脂培养基上，于37℃经24h培养后所生长的细菌茵落的总数 • 细菌总数是检验一般水域污染的标志

33. 6.3.1 细菌总数的监测技术 • 测定细菌总数的主要程序： 1. 灭菌 (1)于热灭菌：将试管、平皿、吸管等玻璃仪器，装入于热灭菌箱中160℃灭菌2h (2)高压蒸汽灭菌：稀释水、培养基、采样瓶等置于高压蒸汽灭菌中，经115℃(10磅／in2)高压蒸汽灭菌20min。 (4)蒸汽灭菌：采用蒸汽灭菌器，在100℃常压下，每次定时灭菌。 (5)火焰灭菌：此法灭菌时应用远火徐徐加热．然后再于火焰焰心灼烧为妥 2．营养琼脂培养基的制备：称取108蛋白胨、3g牛肉膏、5g氯化钠及10一20g琼脂溶于1000m1蒸馏水中，加热至琼脂溶解，调节PH为7．4—7．6过滤，分装于玻璃容器中，经高压蒸汽灭菌20min，贮于冷暗处备用

34. 6.3.1 细菌总数的监测技术 3．试样培养 (1)取定量混合均匀的水样(或稀释后水样)注入灭菌平皿中，倾入15ml已融化并冷至45℃左右的营养琼脂培养基，旋摇平皿使其混合均匀。应做两份实验。 (2)待平皿上试样凝固后，将平皿倒置于恒温箱中37℃培养24h，然后进行菌落计数。 (3)用营养琼脂培养基同时进行空白对照实验 4. 菌落计数：作平皿菌落计数时，可用眼观察，也可用放大镜观察，求出1ml水中的干均菌落数。进行稀释水样计数时，应采用平皿内有30一300个苗落的稀释度进行计算

35. 6.3.2 大肠杆菌的监测技术 • 大肠杆菌(Eshllus coli)是指示粪便污染的重要指示生物 • 在大肠菌群系一群需氧又兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。大肠苗群数指每升水样中所含有的大肠菌群的数目 • 大肠菌群检验方法有发酵法和滤膜法

36. 6.3.2 大肠杆菌的监测技术 1. 发酵法 • 这是根据大肠菌群使乳糖发酵产生酸和气的特性而进行检验，如产破产气者，大肠菌群则为阳性 • 培养基的种类： (1)乳精蛋白胨培养液； (2)三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液； (3)品红亚硫酸钠培养基(供发酵用) (4)伊红美蓝培养基

37. 6.3.2 大肠杆菌的监测技术 • 检验大肠菌群主要程序 • 初步发酵试验：初步发酵试验在灭菌操作条件下，取定量水样加入3倍浓缩乳糖蛋白陈培养液中，于37℃恒温培养24h • 平板分离：经24h培养后，将产破产气及只产酸的发酵管，分别接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，再恒温培养24h，然后分别选择菌落 • 复发酵试验：上述涂片镜检茵落如为革兰氏阴性无芽脑杆菌，可进一步挑取该菌落的另一部分接种于乳糖蛋白胨培养液中，于37℃恒温培养24h，有产酸产气者，即证实有大肠茵群存在 • 大肠菌群计数：根据以上试验证实有大肠茵群存在的阳性管数，查大肠苗群检数表，报告每升水样中大肠菌群数

38. 6.3.2 大肠杆菌的监测技术 2. 滤膜法 • 滤膜是采用一种微孔薄膜，按灭菌操作将水样注入具有滤膜的过滤器中，经抽滤，细菌被截国在膜上，后将滤膜贴于品红亚硫酸钠培养基上，进行恒温培养16—18h，符合上法所述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检 • 凡属革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌者，再接种于乳糖蛋白胨培养18h产酸产气者，判断为大肠菌群阳性 • 1L水样中大肠菌群数等于滤膜上生长的大肠菌群落总数乘以3

39. 6.4生物毒性试验监测技术 6.4.1 水生生物急性毒性试验 • 水生生物急性毒性试验(acute toxicity test for aquatic organism)是测定高浓度污染物在短时期(一船不超过几天)内对水生生物所产生的急性毒性作用，用以评价污染物毒性的实验方法 • 通过水生生物急性毒住试验可以确定半数存活浓度(TLm)或半数致死浓度(TL50)．并用来评价污染物的毒性大小和性质。 • 还可粗略了解毒物引起生物体中毒的症状和特点，以判断毒物的毒性强弱和水环境的污染程度，并为制定在环境中的毒物最大容许浓度提供基本数据

40. 6.4.1 水生生物急性毒性试验 1. 试验生物的选择 • 常用的是小型水生生物，主要是鱼 • 为了避免受试生物个体差异过于悬殊，应选择种属较纯，年龄、大小、体重差别不大．雌雄性别各半的动物 2. 试验容器及设备 • 饲养水槽 • 试验容器 • 恒温设备

41. 6.4.1 水生生物急性毒性试验 3. 实验方法 • 将受试鱼随机分组 • 试验前，受试动物要在实验室内饲养 7—10d，以观察其活动是否正常 • 试验期间，对照组动物的死亡串应低于5％ • 急性毒性试验期间一般不喂食，从致毒开始就观察记录动物中毒表现，生理、生化变化和死亡情况，并将观察结果在半对数坐标纸上用内插法或外推法求出动物的LC50、动物全部死亡的最小浓度(LC100)和动物全部存活的最大毒物浓度(LC0)即最大耐受浓度 • 急性毒性试验的结果同受试动物的种属和稀释水的水质等因素有关

42. 6.4.1 水生生物急性毒性试验 4. 应用系数(鱼类毒性试验) • 根据急性毒性试验求得的半数致死浓度(LC50)或半数存括浓度(TLm)，推算化学物质对鱼类的安全浓度而采用的一种常数

43. 6.4.2 水生生物亚急性毒性试验 • 水生生物亚急性毒性试验(suhacute toxicity test for aquatic ogansism)是测定低浓度污染物在较长时期(一般不超过3个月)内对水生生物所产生的毒性作用，用以评价污染物毒性的一种实验方法 • 进行亚急性毒性试验可以研究污染物对生物的作用方式和致毒机理；通过这种试验可以利用生物对污染物的反应预报污染物的慢性毒性,而试验的结果则可以为制定水质标准提供依据

44. 6.4.2 水生生物亚急性毒性试验 • 试验方法 • 细胞培养是测定污染物亚急性毒性的灵敏而可靠的方法之一 • 组织病变是亚急性毒性常见的一种反应，也是亚急性毒性试验的重要指标之一 • 污染物亚急性毒性作用可引起色类血相、呼吸代谢和酶的活性等生理、生化的变化。对这些变化的测定，可以反映毒物的亚急性毒性作用

45. 6.4.2 水生生物亚急性毒性试验 2. 有关指标 • 耗氧率 • 鳃盖活动频率或呼吸率 • 咳嗽频率 • 存在问题： • 缺乏水生生物正常的生理、生化和行为的资料，因而难以确定试验所观察到的变化是否在生物正常变幅以内 • 这种变化究竞是适应性的(导致种群的维持或扩大)，还是破坏性的(导致种群的毁灭)，暂时还不能下结论

46. 6.4.3 水生生物慢性毒性试验 • 水生生物慢性毒性试验(chromic toxicity test for aquatic or ganism)是测定低浓度污染物对水生生物生活周期内的毒性作用，用以评价污染物毒性的实验方法 1. 试验方法 • 慢性毒性试验可在水生生物的生长、繁殖、卵的孵化和幼体发育等生命活动的各个主要阶段进行。在实验室条件下，一般要使用流水装置，以保持毒物浓度恒定；还要保持生物良好的生活条件，如食物、氧气、pH值等。所得到的存括率、生长率、产卵率和孵化率等数据最后用统计方法处理

47. 6.4.3 水生生物慢性毒性试验 2. 有关指标 • 体长 • 体重 • 骨胶原或核糖核酸(RNA)和去氧核糖核酸(DNA)之比

48. 6.4.3 水生生物慢性毒性试验 3. 试验周期 • 一次试验所需的时间同受试生物种类有关，如以鱼类为试验对象，一般需一年左右,对于一些危害大的累积性污染物如甲基汞、镐和铅等，慢性毒试验不仅要包括一个生活周期，而且要延续三代 • 水生生物慢性毒性试验周期较长。为了缩短周期，一是寻求性成熟时间短的生物作试验对象;二是探索用短期毒性预报慢性毒性的可能性

49. 6.4.3 水生生物慢性毒性试验 4. 毒物最大容许浓度 • 毒物最大容许浓度(maximum allowable concentration for taxicant)指在慢性毒性试验中，毒物对受试生物无影响的最高浓度和有影响的最低浓度之间的阈浓度 • 在鱼类慢性毒性试验中，常采用受试鱼的生产指数来测定化学物质的最大容许浓度

50. 6.4.4 鱼类急性毒性试验操作 • 对鱼类进行急性毒理试验，最主要的是半致死浓度试验(median toleranco limit 缩写MTL) • 选择供试鱼 • 选用大马哈鱼，每尾体重在0.15一0.50g范围之内均可。同一试验使用的鱼应取自同一条件，而且，鱼体的重量也应大致相同 • 排水和稀释水的准备 • 所用排水装满采样瓶后封闭 • 用于稀释排水的水，采用不合可疑成分的pH为6．6--7．4，硬度为10--70mg/L的清净水