1 / 21

Kvantifikace nukleových kyselin

Kvantifikace nukleových kyselin. MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU. Kvantifikace - metody. Kvantitativní PCR Elektroforéza na agarózovém gelu spektrofotometrie. Kvantitativní PCR. Vysoká citlivost a specificita Kvantifikace specifických cílových sekvencí

reia
Download Presentation

Kvantifikace nukleových kyselin

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Kvantifikace nukleových kyselin MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU

  2. Kvantifikace - metody • Kvantitativní PCR • Elektroforéza na agarózovém gelu • spektrofotometrie

  3. Kvantitativní PCR • Vysoká citlivost a specificita • Kvantifikace specifických cílových sekvencí • Kvantita vyjádřena absolutně nebo relativně. • real-time PCR

  4. Elektroforéza • Rozdělení fragmentů DNA podle velikosti • Obarvení • Densitometrické stanovení množství srovnáním se standardem o podobné délce. Delší fragment pohltí více barvy a více „svítí“ • 20ng – 100ng

  5. Spektrofotometrické stanovení • Spousta postupů  • Viz Application Note 54

  6. PCR prakticky MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU

  7. Amplifikace DNA

  8. Základní komponenty reakce • voda • pufr • dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGTP) • MgCl2 • Taq polymeráza • primers • templát

  9. Teplotní režim • 96ºC 5:00 iniciální denaturace • 96ºC 0:30 denaturace • 40-72ºC 0:30 annealing • 72ºC 1:00 elongace • 72ºC 4:00 závěrečná elongace • 4ºC ∞ zchlazení 30x

  10. Ta • Estimation of the melting and annealing temperatures of primer:If the primer is shorter than 25 nucleotides, the approx. melting temperature (Tm) is calculated using the following formula:Tm= 4 (G + C) + 2 (A + T)G, C, A, T - number of respective nucleotides in the primer.Annealing temperature should be approx. 5°C lower than the melting temperature.

  11. Optimalizace PCR • Optimalizace Ta • gradientový cycler • Optimalizace [Mg2+] • tzv. hořčíková řada • Některá „aditiva“ • DMSO, betain, formamid, TMA, síran amonný

  12. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) solution • DMSO has been shown to facilitate DNA strand separation (in GC rich difficult secondary structures) because it disrupts base pairing and has been shown to improve PCR efficiency.

  13. Formamide solution • Formamide has been shown to decrease the temperature necessary for the reassociation of complementary nucleic acids and has been shown to improve PCR efficiency, particularly on difficult secondary structures.

  14. Betaine solution • Betaine has been shown to improve the amplification of DNA by reducing the formation of secondary structure in GC-rich regions. It is an isostabilizing agent, equalizing the contribution of GC and AT base pairing to the stability of the DNA duplex.

  15. Tetramethylammonium chloride (TMA) • Zvyšuje teplotu annealingu primerů, potlačuje vnik nespecifických produktů. • Váže se na AT bohaté oblasti a zamezuje jejich přednostnímu tání v porovnání s CG bohatými oblastmi.

  16. Bovine Serum Albumin (BSA) • Stabilizuje enzymy a zabraňuje jejich adhezi na povrch zkumavek.

  17. Hot Start PCR • Polymerázy, které se aktivují až po zahřátí na vyšší teploty. • Eliminují vznik nespecifických produktů.

  18. Elektroforéza v agarovém gelu

  19. Základní vybavení

  20. transluminátor cycler

More Related