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测定蛋白质浓度

BCA 法. 测定蛋白质浓度. 临床七年 0603 班 范罕英. 【 实验目的 】. 学习掌握 BCA 法测定蛋白质浓度的基本原理。. 【 实验原理 】. BCA(bicinchoninic acid ，二辛可酸 ) 法测定蛋白质的原理与 Lowery 法相似，即在碱性条件下蛋白质与二价铜离子 Cu2+ 络合，并将其还原成一价铜离子 Cu1+ 。一价铜离子和 BCA 试剂反应 , 使其由原来的苹果绿形成稳定的紫蓝色复合物，在 562 nm 有强烈的光吸收，且吸光值和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此可用于蛋白质浓度测定。

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Presentation Transcript

  1. BCA法 测定蛋白质浓度 临床七年0603班 范罕英

  2. 【实验目的】 学习掌握BCA法测定蛋白质浓度的基本原理。

  3. 【实验原理】 • BCA(bicinchoninic acid，二辛可酸)法测定蛋白质的原理与Lowery法相似，即在碱性条件下蛋白质与二价铜离子Cu2+络合，并将其还原成一价铜离子Cu1+。一价铜离子和BCA试剂反应,使其由原来的苹果绿形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm有强烈的光吸收，且吸光值和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此可用于蛋白质浓度测定。 • BCA测定蛋白质的范围是20μg/ml~200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5μg/ml ~10μg/ml。

  4. Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物， 此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物， 在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并 测定样品中蛋白质的浓度。

  5. 【实验器材与试剂】 • 1．器材 • （1）仪器：分光光度计；恒温水浴箱；枪式移液管。 • （2）玻璃仪器：试管13支，吸管2ml 1支、O.1ml 3支。

  6. 2．试剂 （1）试剂A：1％BCA二钠盐 2％无水碳酸钠 0.16%酒石酸钠 0.4％氢氧化钠 0.95％碳酸氢钠 混合，调pH值至11.25。 （2）试剂B：40g/L硫酸铜。 （3）BCA工作液：试剂A 100ml ＋ 试剂B 2ml，混合即成。市面有BCA法试剂盒销售 4）蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白，根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。 （5）待测样品。

  7. 【实验步骤】 1．取试管13支，编号（除空白管只做1管外，其它各号测定管均重复做两管）， 按下表操作并记录： BCA法测定蛋白质含量

  8. 2．以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。2．以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。 3．用测定管平均光吸收值在标准曲线上查出相应的蛋白质含量，计算求出该待测血清蛋白质的含量(g/L)。 4．从标准管中选择一管与测定管光吸收值相接近者，按比色法计算公式计算求出该待测血清的蛋白质浓度(g/L)。

  9. 【思考题】 试比较BCA法与双缩脲法、Lowery法的异同。 为什么BCA法常常用于科研？其有哪些优势？

  10. 双缩脲法测定血清蛋白质含量 【实验原理】 分子中含有两个或两个以上肽键(-CONH-)的化合物， 在碱性溶液中能与硫酸铜中Cu2+反应生成紫红色化合物， 此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键，具有双缩脲反应， 且在一定范围内紫红色颜色的深浅与蛋白质含量成正比 ，因此可以用光吸收法测定样品中蛋白质的含量。

  11. 此方法被科研工作者广泛选用，其特点： 1. 操作简便，快速，比经典的Lowry法快4倍； 2. 灵敏度高，最小检测量达0.5μg； 3. 准确，试剂稳定性好，在20μg/ml~2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系，检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法； 4. 经济实用，测定可在微板孔中进行（待测样品体积为1μl-20μl），可大大节约样品和试剂用量； 5. 抗干扰能力较强，不受绝大部分样品中的去污剂、尿素等化学物质影响。

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