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实验二 RNA 提取、 逆转录 PCR

实验二 RNA 提取、 逆转录 PCR. （ 8 ： 00~8 ： 05 ）. 实验回顾. 实验一、基因组 DNA 的提取、 酶切及电泳. 2-3min. 目的 DNA 片段. 质粒. TA 载体. PCR. 连接. 目的 DNA. 重组质粒. 转化. 含抗生素培养基中生长. 平板筛选. 无质粒的 E.Coli 死亡. 有质粒的 E.Coli 存活. （ 8 ： 05~8 ： 15 ）. 实验二 RNA 提取、逆转录 PCR. 实验内容 1 、小鼠肝脏组织总 RNA 的提取；

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实验二 RNA 提取、 逆转录 PCR

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  1. 实验二 RNA提取、 逆转录PCR

  2. （8：00~8：05） • 实验回顾 实验一、基因组DNA的提取、 酶切及电泳

  3. 2-3min 目的 DNA片段 质粒 TA载体 PCR 连接 目的 DNA 重组质粒 转化 含抗生素培养基中生长 平板筛选 无质粒的E.Coli 死亡 有质粒的E.Coli 存活

  4. （8：05~8：15） 实验二 RNA提取、逆转录PCR 实验内容 1、小鼠肝脏组织总RNA的提取； 2、RNA的琼脂糖凝胶电泳； 3、以总RNA为模板的逆转录反应； 4、以cDNA为模板的特定基因的RT-PCR: 注：本次实验扩增GAPDH基因(746bp) 5、 PCR产物的电泳及回收

  5. 总RNA 真核细胞的RNA主要分为： 1、mRNA: 1-5% 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt

  6. RNA提取操作注意事项 RNA分离的关键因素是减少RNA酶污染。 RNA酶是一类自然界中广泛存在、生物活性非常稳定的酶类。环境中的灰尘、人体汗液、唾液、实验器材表面。RNase耐热、耐酸、耐碱，不需要辅助因子就具有活性作用。 1、尽量避免外源性RNase 污染 a. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 b. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） c.一次性塑料器材最好是新开封并经过DEPC水处理及高压灭菌。 d.玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。对玻 璃器材还应该进行高温烘烤。 2、应用RNase 抑制剂抑制内源性RNase 活性。

  7. （8：15~9：05） • 第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA 1）将1 ml Trizol 试剂分装到Eppendorf 管中备用。 2）实验教师操作:取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3）将研磨后的组织（小米粒大小）转移至1 ml Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上，使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4）室温孵育10 min。 发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。 强调肝脏组织块不宜过大,研磨要彻底。

  8. 室温孵育10 min 课间介绍 RNA提取的几种方法 1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。

  9. RNase抑制剂介绍 1、DEPC, 二乙基焦炭酸盐 RNA操作时最常用的RNase抑制剂，对核酸酶有 很强的抑制作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。 使用方法：用来去除溶液中的RNase 。RNA提取中 所有液体试剂都应该用DEPC处理。 有效浓度：0.05%---0.1%，室温磁力搅拌20分钟。 灭活条件：高压消毒，或70 C 1 h。 在Tris溶液中半衰期为1.25min。 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。 2、肝素 使用浓度：0.1—10mg/ml 效 果: 37 C 时，可抑制95%的RNase 活力。 如果与DEPC联合应用， 具有极强的抑制 效果。

  10. 9：05~10：05 • 第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA 室温孵育10 min 结束 5）加入200 l氯仿，震荡混匀20-30 s，室温放置5 min （此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体） 10, 000 rpm，离心 5 min (统一离心) 7）将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。 RNA (清澈透明) Protein DNA

  11. RNA提取: RNA (清澈透明) Protein DNA

  12. 离心10分钟时—课间休息 8）沉淀RNA：加0.5 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温10 min。 10, 000rpm，4C，(统一) 离心10 min，弃上清。 10）加1ml 75%乙醇洗涤。 11）7500rpm，4C 离心 1 min，弃上清 再离心几秒钟，将管壁液体完全移净。 注意： 75%乙醇的作用： 不起沉淀作用，只是为了清洗管壁 加入方法一定是贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀 在用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行，当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，而且尽可能快地进入下一个环节。

  13. 12）室温干燥3－5 min（根据RNA沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，避免过分干燥,此步骤非常关键。） 注意事项： RNA: 自然室温干燥 避免放在37oC孵箱中过度干燥以防无法溶解。 RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因 。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状。 RNA pellet： 乳白色，透明胶样 干燥后无色透明

  14. RNA的溶解： 13）用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 18l，加到RNA上，进行吹打溶解RNA 沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。 14) 吸出 9 l溶液放到冰上备用(将用于电泳). 15) 剩余 9 l溶液,放到冰上备用（用于RT－PCR）. • 注意：RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶解。 判断溶解程度： 吹打时液体流动不拐弯为止。 避免气泡的方法： 用加样器的第一挡 每次吹打都不要打出气体

  15. AAAAAA(n) AAAAAA(n) AAAAAA(n) • RT第二部分：逆转录反应 (RT) 逆转录酶： 存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC 。 以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNA－cDNA。 RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。 • RT mRNA 68-70oC, annealing 10min mRNA 3-TTTTTT(18)-5 37-42oC, RTase 1-2h mRNA 3-TTTTTT(18)-5 cDNA

  16. 按照下列配方进行RNA的RT反应： 第一步： 总RNA 9l Oligo dT (0.05g/ml) 1l(终：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合， 置65℃水浴10min后， 立即冰浴2min。 在水浴10分钟时，开始RNA电泳。

  17. 关键点： • RNA是否充分溶解 • 根据组织或细胞的量确定逆转录反应的体积，通常利用1ml Trizol试剂提取出来的总RNA适合于20l体积的逆转录反应体系。 • 引物的量是否合适 • 高温退火避免Oligo dT锚锭点错误，同时，打开RNA链之间的二级结构，利于RT。 • 退火后一定迅速放在冰上 RT引物的用量非常少，因为模板量是固定的，而且只进行一次反应。 在水浴10分钟时，开始RNA电泳。

  18. 将RNA 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳 9 l RNA 样品 2~3 l上样液轻轻混匀， 上样 电泳: 120伏，10～20分钟 注意: 电泳槽的清洁及新的电泳液！ 琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果

  19. RNA电泳结果 rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。 RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。 重点讲解28S、 18S和5S的比例。

  20. RNA电泳结果分析 分析本次实验结果：28S、 18S和5S的比例。

  21. 第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂：第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂： 5RT-buffer 4 l RNasin (40U/ml) 1 l dNTPs (10mmol/L) 4 l AMV 1 l 轻弹管底混合，可用离心机甩一下。 置42 oC 水浴1h。 将上述反应移至68 oC水浴10min以灭活 RTase，并冰浴，保存备用。 （10：30~11：30 由老师结束实验，放-20 oC，下午使用 ）

  22. PCR 操作 在一微量离心管中依次加入下列试剂： cDNA 4l 10PCR buffer（含MgCl2） 5 l dNTPs (10mmol/L) 1 l 5’引物 (10mol/L) 1 l 3’引物 (10mol/L) 1 l 去离子水（补足反应体系）39 l Taq DNA pol. (2U/l) 1 l 轻弹管底混合（用离心机甩一下） 50l 注意：最后加入Taq 酶。

  23. 根据待扩增基因片段的长短确定具体反应条件，一般情况下，基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行PCR。根据待扩增基因片段的长短确定具体反应条件，一般情况下，基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行PCR。 PCR仪设定的反应条件： 94oC 45 S DNA变性 55 oC 45 S DNA复性 72 oC 1 min 产物链延伸 25-30个循环后 72 oC 10 min

  24. PCR反应期间讲解： 1：20~3：00 PCR仪介绍： 如果下面加热的PCR仪，加入2滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。 如果上盖加热的PCR仪，可以直接放入仪器中进行PCR；

  25. PCR仪内发生的反应

  26. PCR反应注意事项： 1）对于定性分析特定基因在不同样本中的表达情 况时，一定要防止污染，尤其是PCR产物的污 染，为了排除假阳性结果，各种对照是必不可 少的。 2）模板不是越多越好，模板过多，当引物与模板 退火时会发生模板先互补结合，引物无法与模 板结合，因此，适量模板量是非常重要的。 模板过多还能大量消耗镁离子。

  27. 根据待扩增基因片段的大小确定延伸时间，小于500bp，一般采用1分钟即可，大于500bp，可采用2分钟，但一般超过2000bp，一般可适当延长延伸时间2-3分钟。根据待扩增基因片段的大小确定延伸时间，小于500bp，一般采用1分钟即可，大于500bp，可采用2分钟，但一般超过2000bp，一般可适当延长延伸时间2-3分钟。 变性 温度一般选用941oC，变性时间可根据模板大小和浓度确定，一般采用30秒。 退火温度与引物序列关系非常密切，退火时间与引物长度和GC含量有关。 引物长度一般在15-25bp之间。 Tm=4(G+C)+2(A+T) 如何确定PCR的变性、退火和延伸温度和时间？

  28. RT的引物选择： • Oligo (dT)15-18 • Random primer 因为基因序列与mRNA序列是一致的。 • Specific anti-sense primer 病毒RNA作为RT模板时，一定要知道病毒是属于哪一种病毒：正链RNA病毒？负链RNA病毒？ • 正链RNA病毒：RT引物用anti-sense primer； • 负链RNA病毒：RT引物用sense primer。

  29. PCR反应相关问题： 1.为什么要加入镁离子？ 镁离子是Taq DNA聚合酶的辅酶，2.0mM的浓度时酶活性最高。镁离子能够和负离子集团结合，在PCR反应中，模板DNA、引物DNA、dNTP均可和镁离子结合，尤以dNTP影响最大。一般镁离子应比dNTP高0.5-1.0mM。 2.dNTP的浓度对PCR有什么影响？ dNTP浓度过高，除容易引起碱基错配外，还可结合镁离子。 3.为什么有时候需要进行热启动？ 热启动就是让DNA在变性温度下开始，Taq DNA聚合酶在DNA双链充分打开之后再加入PCR反应体系中，这样可以保证模板DNA变性充分，引物结合顺利并特异。

  30. 4、DNA聚合酶： 1）Taq DNA聚合酶的特性: 半衰期：95oC ，40分钟 活 性：5`--3`方向的聚合酶活性。 5`--3`外切酶活性。 缺乏3`--5`外切酶活性。 因此没有校正功能。 2）Vent-TM DNA聚合酶： 半衰期：100 oC ，95分钟 活 性：还具有3`--5`外切酶活性。

  31. 引物设计 1、GC比值：碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条 氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR退火温度的 重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半。 2、引物特异序列的长度至少为15-18bp。 3、引物的方向：引物的方向永远是5‘→3’方向，正向（Sense）引物是与一股模板DNA序列相一致的，而反向（Antisense）引物则与这股模板DNA序列相互补。 4、 引物的酶切位点：通常在引物的5‘-端设计适当的限制 性酶切位点。两种酶切位点使克隆具有方向性。 5、引物上启始和终止密码：如果想表达DNA片段，所 用的载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在 引物的酶切位点之后、特异性DNA序列之前。 6、如果表达的蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要 的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。

  32. 引物设计方法例：

  33. 通常在引物的5‘-端设计适当的限制性酶切位点通常在引物的5‘-端设计适当的限制性酶切位点

  34. 凝胶成像系统：

  35. 凝胶成像系统：

  36. 播放 PCR Flash 动画 PCR在法医学上的应用

  37. 引物的配制： • 注意： • 计算一管引物的总含量或克分子数 • 先配成100mM的浓度作为储存液 • 工作液可以通过稀释获得 Primer 1: OD=5 切记： 不要将合成回来的引物一次性配成工作液！ • 如果需要反复应用的引物，配制后一定要分装保存，一段时间后弃掉。

  38. PCR: • 退火温度的变化是根据引物的GC比例确定或估计的； • 退火时间的变化是根据引物的长度调整的。 PCR的基本流程： 94oC, 45 sec 55oC, 1 min 72oC, 2 min 两种方式加入DNA聚合酶： 热启动结束后暂停PCR反应，在PCR仪上直接趁热加入DNA pol； 热启动结束后将反应管迅速放在冰上，然后加入DNA pol。 热启动： 避免发夹结构或其他二级结构影响引物的退火。

  39. PCR的反应体系： 模板cDNA 2 l 10buffer (MgCl2): 5 l 引物: anti-sense (10mM) 0.5l sense (10mM) 0.5l dNTP (10mM): 1 l Taq DNA pol (5U/l): 0.25 l Add ddH2O to final volume 50l • 记住： • 引物和模板的退火是随机碰撞的结果。 • 加入顺序不是随机的：DNA聚合酶一定要最后加入。 加各种成分一定要在冰上进行。

  40. 70oC 60oC 退火 延伸 变性 用PCR合成基因： 第一对互补引物按1:1比例加入。 5 3 3 5 注意： PCR产物一定要从胶上纯化后再用。 以后的PCR以第一轮产物为模板。

  41. 实验课结束，请值日生值日。

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