第十二章
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第十二章. 分子生物学常用技术 及其应用. 序言. 21 世纪是 生命科学 的世纪!. 生物技术 是当今发展最快、最活跃、 对社会与经济的发展有巨大推动力的高科技领域。其中 基因工程 和 发酵工程 是生物技术的核心。. 世界各国政府高度重视 生物技术. 我国政府将其列为信息通讯、航天、新能源、 新材料等高科技领域的 第二位 。可见其战略地位。. 生物技术 正在改变人们的生活和观念. 随着 基因组计划 的接近完成及 后基因组计划 的开展,借助计算机处理复杂信息的强大能力, 21 世纪的 生物技术 将会有更大发展,有些领域甚至可能有重大突破。.

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第十二章

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第十二章

分子生物学常用技术

及其应用


4571230

序言

21世纪是生命科学的世纪!

生物技术是当今发展最快、最活跃、 对社会与经济的发展有巨大推动力的高科技领域。其中基因工程和发酵工程是生物技术的核心。

世界各国政府高度重视生物技术

我国政府将其列为信息通讯、航天、新能源、 新材料等高科技领域的第二位。可见其战略地位。

生物技术正在改变人们的生活和观念

随着基因组计划的接近完成及后基因组计划的开展,借助计算机处理复杂信息的强大能力,21世纪的生物技术将会有更大发展,有些领域甚至可能有重大突破。


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第一节 自然界的基因转移和重组

一、接合

质粒DNA从一个细胞转移至另一细胞

二、转化

通过自动获取或人为地供给外源DNA,使细胞获得新的遗传表型

三、转导

病毒把某一细胞的DNA带至另一细胞,

使后者获得新的遗传表型

四、转座

DNA片段从染色体的某处移位到另一处。


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四、基因重组(recombinant)

不同DNA分子间发生的共价连接

重组的类型:

  • 位点特异性重组

    (site-specific recombination)

    2. 同源重组

    (homologous recombination)


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A

B

A

a

B

A

b

B

a

b

a

b

A

a

b

A

B

b

B

a

1. 同源重组(homologous recombination)

机制

同源区

功能

1. 在减数分裂过程中,同源染色体之间

进行交换,形成生物个(群)体的多样性。

2. 是DNA损伤修复的重要机制之一。


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2. 位点特异性的基因重组

由整合酶催化,重组仅在特定的基因片段和位点上进行。

是免疫球蛋白多样性的分子机制。


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第二节

基因工程的工具——工具酶和载体


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一、 常用的工具酶

(一)限制性内切酶(restriction endonuclease)

---切——基因工程的手术刀

没有限制性内切酶的发现和应用,就很难有今天分子生物学与基因工程的快速发展。

识别双链DNA中特异序列,该序列的特征为4-6个核苷酸的回文结构,并在识别序列内或附近特异切割DNA,产生粘性末端或平末端。

功能:

根据需要在特定的位点精确切割

双链DNA分子


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3′

5′

**********GAATTC********

**********CTTAAG********

3′

5′

5′

3′

3′

5′

—OH

*********G

A A T T C*********

P

G*********

OH—

P

*********C T T A A

3′

5′

3′

5′

作用模式图:

1. 产生5′突出粘性末端(sticky end)

EcoR I


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5′

3′

**********CTGCAG**************

**********GACGTC**************

3′

5′

5′

3′

5′

3′

—OH

*********C T G C A

G***********

P

OH—

A C G T C***********

*********G

P

3′

5′

3′

5′

作用模式图:

2. 产生3′突出粘性末端

Pst I


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5′

3′

*************AGCT*************

*************TCGA*************

5′

3′

5′

3′

5′

3′

—OH

CT*************

*************AG

*************TC

P

GA*************

OH—

P

3′

5′

3′

5′

作用模式图:

3. 产生平末端(blunt end)

Alu I


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限制性内切酶用途:

  • 基因重组过程中切割DNA以获取目的基

  • 因片段,切割载体形成切口,使目的基因能插入载体中。

2.限制性片段长度多态性(Restriction

Fragment Length Polymorphysms,

RFLP)分析:遗传病的诊断,法医

DNA指纹分析等。

3.构建DNA的物理图谱,基因定位,DNA的

同源性分析等等。


Dna dna ligase

(二)DNA连接酶(DNA ligase) ——基因工程的缝纫针

催化两条双链DNA分子的互补粘性末端或平末端的5′磷酸基团与3′羟基形成磷酸酯键。

功能:

将两条双链DNA片段连接起来,实现 DNA的体外重组。


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DNA连接酶催化平末端连接要比粘性末端 效率低得多。

也可将双链DNA分子内部的单个切口(无核苷酸空缺)连接起来。还可作用于RNA,但效率很低。

如需连接单链DNA或RNA,则需用RNA连接酶。


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5′

3′

5′

3′

A A T T C*********

—OH

*********G

P

G*********

OH—

*********C T T A A

P

3′

5′

3′

5′

5′

3′

**********GAATTC**********

**********CTTAAG**********

5′

3′

DNA连接酶

作用模式图:

1. 连接粘性末端

DNA连接酶

EcoR I


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5′

3′

5′

3′

—OH

************TC

************AG

CT*************

P

GA*************

OH—

P

3′

5′

3′

5′

5′

3′

*************AGCT**************

*************TCGA**************

3′

5′

作用模式图: 2. 连接平末端

DNA连接酶

Alu I


Reverse transcriptase

(三) 反转录酶(Reverse Transcriptase)

功能:

1. RNA指导的DNA聚合酶活性:

以RNA为模板,以带3′-OH末端的DNA片段为引物, 沿5′至3′方向合成DNA链。

3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′

5′TTTTTTT—OH 3′

dNTP

Mg2+

反转录酶

3′AAAAAAUCUGUCCUA……5′

5′TTTTTTT

AGACAGGAT……3′


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功能:

2. DNA指导的DNA聚合酶活性;核糖核酸酶H活性;DNA解旋酶活性等。

用途:

1. 反转录酶的最主要作用是以mRNA

为模板合成互补DNA(complementary

DNA,cDNA)。

2. 以单链DNA或RNA为模板制备探针。


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(四) 核酸酶S1

功能:

水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分。

核酸酶S1

核酸酶S1

+

核酸酶S1


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(四)核酸酶S1

用途:

1. 除去双链DNA的粘性末端以产生

平末端;

2. 除去cDNA合成时形成的发夹结构;

3. 分析RNA的茎环结构以及DNA-

RNA分子的杂交情况等。


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催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3′-OH末端上。

功能:

  • 底物是单链DNA或有3′突出末端的

  • 双链 DNA。

Mg2+

3′

3′

5′

5′

OH

(A、G、C、T)n

nppi

dNTP

Mg2+

OH

(A、G、C、T)n

3′

3′

5′

5′

dNTP

nppi


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2.底物是平端或3′ 凹端的双链DNA。

3′

5′

3′

5′

Co2+

OH

(A、G、C、T)n

nppi

dNTP

Co2+

OH

(A、G、C、T)n

3′

5′

3′

5′

dNTP

nppi


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用途:

1. 主要作用是在载体或目的基因 3′末端加上同源多聚尾巴,形成人工粘性末端,便于DNA重组。

2. DNA 3′末端的同位素标记。


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(六) 核糖核酸酶H

功能:

水解DNA-RNA杂交分子中的RNA链。

核糖核酸酶H

RNA

DNA

DNA

用途:

用核糖核酸酶H部分水解mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA,使未被水解的mRNA作为引物合成cDNA的第二链。


Vector

二、载体(vector)

  • 目的基因进入原核或真核细胞并高效复制

  • 和表达蛋白质,需要装入载体才能实现。

  • 作为基因工程载体所需具备的基本条件:

1. 能自我复制,并具一定的拷贝数。

2. 带有抗性基因,便于筛选和鉴定。

3. 在适当的位置有单酶切位点,便于重

组操作。

4. 带有强启动子,驱动目的基因在宿主

细胞内高效表达。


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基因工程载体的种类和用途:

1. 细菌质粒:最常用的用于目的基因克隆或

表达的载体。

2. 噬菌体:主要用于构建基因组DNA或

cDNA文库。

3. M13噬菌体:专用于Sanger双脱氧DNA

测序

4.粘粒:用于克隆大片段DNA。

5.酵母质粒:用于在酵母中表达目的蛋白。

6.病毒:包括人或哺乳动物病毒、昆虫病毒及植物病毒。用于在真核细胞中表达目的蛋白。


Plasmid

(一) 质粒(plasmid)

定义:细菌染色质以外的双链环状DNA,

能自我复制和表达其携带的遗传信息。

质粒

染色质

细菌培养

质粒扩增并表达蛋白质

大肠杆菌


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pBR322质粒:一种克隆质粒

结构:

ORI:复制起始点,

保证高拷贝自我复制。

Ampr,Tetr:

Ampr

两个抗性基因用于

筛选阳性克隆。

Tetr

Pst I, BamH I:

ORI

两个单酶切位点用于插入目的基因


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pfxBlue: 克隆质粒

Ampr

MCS

MCS:Multiple Clonning Site

提供多个单酶切位点用于克隆操作

LacZ

LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆


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pRS426:原核细胞表达质粒

LacZ

Ampr

MCS

P(LacZ)

P(LacZ): LacZ启动子

用于在原核细胞驱动目的基因的表达。


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pcDNA3:真核细胞表达质粒

Pcmv:

CMV增强子/启动子

驱动目的基因在真核细胞内表达

BGH pA:加尾信号

目的基因转录后加上polyA尾,使其更稳定。


Phage

(二) 噬菌体(phage)

1. 噬菌体(phage)

2. 粘粒(cosmid)

3. M13噬菌体


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调控区

结构区

裂解区

1. 噬菌体

cos位点

A WB DEF ZJ att xis N cl cro O P Q SR

cos

位点

重组区

EcoRI

EcoRI

EcoRI

A

R

A

R

目的基因

插入型

置换型


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  • 重组噬菌体的分子量必须在野生型噬

  • 菌体 分子量大小的75%至105%之间。

筛选标记:蓝白斑(LacZ)、噬菌斑等。

用途:

a.用作一般的克隆载体。

b.用于构建基因组或cDNA文库。

c.用于抗体库或随机肽库的构建。


2 cosmid

2. 粘粒(cosmid)

组成:

1. 质粒复制的起始位点(ORI);

2. 抗性基因;

3. 用于插入目的基因的单个酶切位点;

4. 噬菌体的cos位点。

可见,cosmid是由质粒和噬菌体的cos位点构建而成。


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特点:

  • 可插入长达27~41kb的外源基因,方便地用于克隆大片段DNA。

  • 加入噬菌体头部和尾部蛋白,可将

  • 粘粒包装成类似于噬菌体的具感染能力的颗粒,方便地进入大肠杆菌。

  • 粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体

  • 的功能,而表现质粒的特性。


3 m13

3. M13噬菌体

3′

5′

经pII蛋白

造缺口

复制

复制型

DNA

噬菌体

正链

进入下

一循环

5′

3′

3′

经pII

蛋白

剪切

5′

滚环复制

释出单链DNA(正链)

在细菌内的复制模式图


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M13噬菌体几个重要特点:

1. M13噬菌体不溶解宿主细胞,只是降

低宿主细胞的生长速度。

2. M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在,因此可以用感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。

3. 克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。


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M13噬菌体用途:

1. DNA序列测定;

2. 制备单链DNA探针;

3. 用于定点突变的研究。


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第三节

基因工程的步骤


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基因工程的基本步骤

1.基因工程的上游技术:基因重组

+

目的基因

载体

连接

+

转化、筛选和鉴定阳性克隆

含重组子的阳性克隆

分、切、接、转、筛


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基因工程的基本步骤

2.基因工程的下游技术:

(1)发酵工程

发酵条件(生物反应器结构、细菌培养温度、空气通量、pH及培养基成分等)的优化组合。

(2)蛋白质的分离、纯化与质量鉴定


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一、 目的基因的制备—分

(一) 人工合成法(也即化学合成法)

本方法适用于分子量较小的目的基因 (100bp以内)。

缺点:

1. 只能合成较小片段的DNA(100bp以内)。

2. 如目的基因DNA序列需通过氨基酸序

列推测,难于保证与天然基因序列一

致,往往导致表达效率大大降低。


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(二)反转录法

本法是应用得最多的获取目的基因的方法。但前提是目的基因的序列已知,至少部分已知。


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(二)反转录法:

加热变性

方案:

TTnT 5′

AAnA

加入特异性引物

3′

5′

mRNA

反转录酶

cDNA

3′

TTnT

5′

AAnA

3′

5′

mRNA

DNA聚合酶

核糖核酸酶H

cDNA

3′

TTnT

5′

DNA poly I

重复上述步骤

核酸酶S1

扩增出大量的产物

聚合酶链式反应(Polymerase

Chain Reaction,PCR)

双链cDNA


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(三)直接从染色体DNA中分离

根据染色体DNA的限制性内切酶图谱,用合适的限制性内切酶切割染色体DNA,分离目的基因。

  • 本方法较适用于制备原核生物目的基因,其原因为:

1. 真核细胞染色体DNA有丰富的内含

子,在原核细胞中转录后不能剪接。

2. 真核细胞的基因多数为单拷贝,难

于分离到足够的目的基因。


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(四) 从基因文库(gene library)中获取

基因组文库:G-文库

cDNA文库: c-文库

(常用)

方法:

用目的基因上的一段

DNA做成探针与文库中的

DNA作核酸杂交,从基因

文库中“钓出”有目的基

因的克隆。

基因文库


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二、构建DNA重组体---接

(一)粘性末端连接

质粒

目的基因

用同一种或两种

限制性内切酶酶切

本法适用于在质粒和目的基

因上有相同单或双酶切位点

DNA连接酶

重组质粒


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(二)平末端连接

产生粘性末端

的内切酶

产生粘性末端

的内切酶

质粒

产生平末端的

内切酶

核酸酶S1

目的基因

核酸酶S1

DNA连接酶

本法适用于在质粒

和目的基因上没有相

同的酶切位点!

重组质粒


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(三)用接头连接

+

+

接头(linker)

目的基因

DNA连接酶

质粒

用同一种

限制性内切酶酶切

DNA连接酶

本法适用于在质粒

和目的基因上没有相

同的酶切位点!

重组质粒


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(四)尾接法

质粒

目的基因

内切酶

末端转移酶

+dCTP

末端转移酶

+dGTP

DNA连接酶

本法适用于在质粒

和目的基因上没有相

同的酶切位点

重组质粒


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三、将重组体(子)导入宿主细胞---转

1. 重组质粒的导入方法

大肠杆菌

0~4℃

CaCl2

感受态细胞

重组质粒

转化

transformation

含重组质粒的大肠杆菌


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三、将重组体导入宿主细胞

2. 重组病毒或重组噬菌体的导入方法

重组病毒

重组噬菌体

加入病毒的

某些蛋白组分

具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒

转染(transfection)

真核细胞

原核细胞


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四、重组体的筛选与鉴定---筛

1. 插入失活: 例1 在Tetr中插入目的基因

在质粒固有的功能基因内插入目的基因,则该基因不能表达有功能的蛋白质。

Ampr

Terr


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例1:

1 2 3

1 2 3

4 5 6

4 5 6

Amp

Tet

3和5是阳性克隆


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四、重组体的筛选与鉴定

Apmr

MCS

1. 插入失活:

例2 在Laz中插入目的基因

LacZ


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例2:蓝白斑筛选

Lac-Z基因

-半乳糖苷酶

蓝色化合物

X-gal


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2. 菌落原位杂交

取下沾

有菌落

的滤膜

覆盖

滤膜

1 2 3

4 5 6

放射性

自显影

与探针

杂交

裂解、

变性、

固定等

3和5是阳性克隆


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五、基因工程的下游技术

(一)细菌发酵

发酵条件(生物反应器的结构、细菌

培养的温度、空气的通量、pH及培养基

成分等)的优化组合。

(二)蛋白质的分离、纯化与质量鉴定


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六、基因工程中几个棘手的问题

  • 1. 原核细胞的RNA聚合酶不能识别

  • 真核细胞的启动子。

  • 2. 原核细胞不能剪接真核细胞

  • 带内含子的mRNA。

  • 3. 原核细胞表达出的真核细胞蛋白质

  • 往往无活性。

  • 4. 用真核细胞表达系统虽然可以表达有活性的蛋白质,但其产量太低,成本太高。


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第四节 基因工程在医学上的应用

  • 现代医学越来越重视活性蛋白质在预防

  • 和治疗疾病中的作用。

  • 基因工程可大量生产天然稀有存在的

  • 重要的肽或蛋白质。

  • 基因工程可根据人的意愿设计生产出

  • 天然不存在的有重要生物活性的肽或

  • 蛋白质。

  • 人类基因组计划及后基因组计划的成果

  • 将为基因工程提供难于估量的广阔发展

  • 空间。


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一、基因工程生产的药品

1.基因工程疫苗

乙肝,丙肝,爱滋病,流行性感冒,出血热,人乳头瘤病毒,巨细胞病毒等。

结核,麻风,霍乱,痢疾,肺炎等。

血吸虫,疟疾等。

各种肿瘤疫苗。

……


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2. 人体活性因子

  • 干扰素(IFN):

IFN-,IFN-,IFN-。

  • 白细胞介素(IL):

IL-1,2,3……13。

神经生长因子,表皮生长因子,成纤维细胞生长因子等。

  • 生长因子:

  • 集落刺激 因子(CSF):

干细胞-CSF,粒细胞-CSF,粒细胞-巨噬细胞-CSF。


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2. 人体活性因子

  • 治疗心血管及血液病的活性肽

红细胞生成素(EPO),超氧化物歧化酶(SOD),组织纤溶酶原激活物(tPA)等。

  • 激素

胰岛素,生长激素,生长抑制激素等。

……


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  • 主要发展趋势

  • 完善现有的原核和真核细胞表达体系

  • 建立新的表达体系

  • 改进和发展大规模动、植物细胞培养技术

  • 应用转基因动、植物作为生物反应器高产量、高质量、低成本生产名贵生物药物。


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二、 基因诊断

  • 基因诊断的概念

  • 基因诊断所应用的主要技术

  • 聚合酶链反应(PCR)

将痕量的难于检测到的特定的基因片段成百万地特异地扩增。

  • 核酸探针技术

用已知的与疾病相关或特异的核酸片段(探针)与待测样品作核酸杂交,检测样品是否有该特征性DNA片段以及量的多少。


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核酸探针技术

  • Southern Blot: 印迹DNA

  • Northern Blot: 印迹RNA

  • 原位杂交技术

  • 寡核苷酸探针技术

  • RT-PCR

  • PCR-单链构象多态分析(PCR-SSCP)


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  • 基因诊断的疾病谱:

遗传性疾病,感染性疾病,心血管疾病,肿瘤,...

  • 发现并获得某种疾病的特异性基因是基因诊断的基础。

人类基因组计划,后基因组计划,特别是疾病基因组计划将极大地推动这一进程。


Gene therapy

三、基因治疗(gene therapy)

  • 定义:

一切通过基因水平的操作而达到,

治疗疾病目的疗法。

  • 基因治疗的策略

  • 1.基因置换:以正常基因替换缺陷基因。

  • 2.基因补偿:导入正常基因,补偿缺 陷基因的功能。

  • 3.基因失活:用反义核酸封闭有害基因的表达。


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  • 4. 免疫基因治疗:将免疫增强因子基因(如MHC,IL)导入肿瘤细胞,提高其免疫原性。

  • 5. 活化前体药物基因治疗:

  • 向肿瘤细胞导入一种基因,该基因产物为一种酶,它可将无细胞毒的药物前体转化为有毒性的药物,从而将细胞杀死,也称自杀基因治疗。

  • 6. 耐药基因治疗:

  • 将抗药物毒性的基因导入对化疗药物敏感的组织细胞(如骨髓干细胞),提高其对药物的耐受性。


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目前基因治疗面临的问题

  • 1. 目的基因的表达水平太低或难于精确控制。

  • 2. 目的基因的转移和表达缺乏足够的

  • 靶向性。

  • 3. 对基因表达调控、基因表达产物的功能的认识还很少、很肤浅。


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