细胞培养基本技术

1. 细胞培养基本技术

2. 基本概念 **细胞培养 (cell culture)： 是把取得之组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养生长。 体外培养（In vitro） **组织培养 (Tissue culture)： 把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。 **器官培养 (Organ culture)： 系将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。

3. 基本概念 • 原代培养 源自体内新鲜组织的细胞在体外条件下生长，在传代之前称为原代培养。 • 传代培养 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中

4. 细胞系(cell line) 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。 • 有限细胞系: 细胞系的生存期有限 • 无限细胞系:已获无限繁殖能力、能持续生存的 细胞系 （1）只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性－－转化细胞系 （2）不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化 －－恶性转化细胞系 • 细胞株(cell strain) 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。

5. 细胞培养技术的主要优点 ㈠ 研究的对象是活的细胞。 ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。 ㈤ 研究的范围比较广泛。 ㈥ 研究的费用相对较经济。

6. BGC-823细胞

7. 原代培养细胞的生命归宿 • 原代培养期 • 传代期 • 衰退期

9. 培养细胞的生长方式及类型 • 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。见于各种实体瘤细胞 • 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见于各种造血系统肿瘤细胞

10. 细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板 贴附生长型细胞

11. 成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起 上皮细胞：扁平、多角形、园核 可连成单层

12. 悬浮生长型细胞

13. 每代贴附生长细胞的生长过程 • 游离期 • 贴壁期 • 潜伏期 • 对数生长期 • 停止期（平台期）

14. 游离期： • 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 • 10分钟一4小时

15. 贴壁期： • 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟--4小时贴壁。 • 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 • 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 • 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）

18. 潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。

19. 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

20. 停止期（平台期）： • 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 • 机制：接触抑制、密度依赖性

22. 培养细胞的生长过程 • 单个细胞的生长过程 • 细胞系的生长过程

23. G1期（ DNA合成前期） 间期 S期（ DNA合成期 ） G2期（ DNA合成后期） • 细胞周期 M期（有丝分裂期）

24. 细胞系的生长过程 原代培养期 为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的时期。 原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，此时， 便应将原代细胞分开接种至2个或更多的新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系。 传代期 衰退期 一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰退死亡。

25. 培养细胞生长的条件 • 细胞的营养需要 • 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 • 无污染 • 无毒

26. 无 毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与 细胞直接或间接接触的东西都必须 是无毒的。 细菌 微生物的污染 霉菌 支原体等 无污染 不同细胞类型的交叉污染

27. 细菌污染 能改变培养液的pH值，使培养液变混浊。 细菌生长迅速，能消耗营养液和产生毒素。 抑制细胞的生长，毒性大的细菌可很快导致细胞崩解死亡。

28. 荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体

29. Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体

30. 扫描电镜法显示支原体 附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体

31. 实验准备 实验用品： • 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 • CO2培养箱 • 倒置显微镜 • 酶标仪、微孔板震荡器 • 液氮罐 • 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 • 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管

32. 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 • 电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干玻璃 器皿消毒 • 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、 酶液等均采用滤过法除菌 • 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 • 紫外灯 ：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料 培养皿和培养板等表面消毒

33. 超净台 • 超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

34. 滤 器

36. CO2培养箱 • CO2培养箱设定的条件为37 ℃, 5％ CO2。 • 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的 问题： • ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶 盖微松，以保证通气。 • ②保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90 ℃ ，14 h)。 • ③箱内加灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水于 槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。

38. 自动双重纯水蒸馏器 纯水仪

39. 酶标仪 微孔板震荡器

40. 培 养 板

41. 培养瓶

42. 细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒

43. 清洗 • 在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长 • 微生物产品附带杂物 • 上次细胞残留物 • 非营养成分的化学物质 • 需要清洗的培养用品 • 玻璃器皿的清洗 • 胶塞的清洗 • 塑料制品的清洗

44. 玻璃器皿的清洗 • 包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤 • 清洗后的玻璃器皿 • 干净透明无油迹 • 不能残留任何物质

45. 浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉 • 新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等 • 先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质 • 再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉 • 用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上

46. 刷洗： • 用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质 • 刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度

47. 浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中 • 清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质 • 浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面 • 浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时 • 清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml） • 强清洁液 63∶1000∶200 • 次强清洗液 120∶ 200∶1000 • 弱清洁液 100∶ 100∶1000 • 配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分 • 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色

48. 冲洗 • 在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹 • 最好用洗涤装置 • 如用手工操作 • 需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用

49. 胶塞的清洗 • 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理 • 常规清洗方法 • 每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用

50. 塑料制品的清洗 • 塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品 • 必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用